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目的1.探讨冬凌草甲素系类似物对肿瘤细胞增殖能力的影响,筛选具有抗肿瘤活性的化合物,考察其对食管癌细胞EC109增殖、凋亡、活性氧的影响及其作用机制。2.探讨化合物2y对裸鼠移植瘤生长的影响,及其体内相关分子机制。方法1.采用SRB染色法考察冬凌草甲素类似物系列化合物作用72 h后对四种肿瘤细胞(MGC-803、TE-1、EC109、MCF-7)增殖的影响。2.采用SRB染色法考察化合物作用24、48、72 h对食管癌细胞EC109增殖的影响;采用细胞克隆形成实验考查化合物对食管癌细胞EC109的影响;采用流式细胞术考察化合物2y对于EC109早期和晚期凋亡的影响;同时考察化合物2y对EC109活性氧水平的影响;以及化合物2y对细胞线粒体膜电位的影响。采用Western Blotting实验检测细胞凋亡和活性氧通路的相关蛋白,探讨化合物2y在食管癌细胞EC109上的抗肿瘤机制。通过加入活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)进行干预,进一步证实化合物2y对细胞内活性氧水平的影响。3.利用裸鼠人癌EC109细胞移植瘤模型,考察化合物2y动物体内的抗肿瘤作用。利用HE染色实验考察化合物2y对体内肿瘤细胞的作用。观察用药期间的裸鼠体重的变化,进一步通过HE染色实验和血液生化指标的结果,对化合物2y在动物体内的安全性进行了初步评价。采用Western Blotting检测了凋亡通路和活性氧通路的相关蛋白,探讨化合物2y在体内的抗肿瘤机制。结果1.SRB实验结果显示,冬凌草甲素类似物中大部分化合物对四种细胞系的IC50低于1 μM,这显示出良好的抗肿瘤活性。我们从该系列化合物中选取了化合物2y,其IC50分别是:MGC-803约为0.20±0.01 μM、EC109约为 0.13±0.01 μM、TE-1 约为 0.27±0.02 μM、MCF-7 约为 0.35±0.03 μM。2.SRB实验结果表明,化合物2y对EC109细胞增殖能力具有明显抑制作用,并呈现浓度依赖性。克隆形成实验结果表明,化合物2y对EC109细胞的克隆形成能力具有抑制作用。流式细胞术相关实验结果表明,化合物2y使食管癌细胞EC109线粒体膜电位降低,进而导致凋亡比例上升。Western Blotting的结果显示,化合物2y组的线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、Bad、Bim、Cyc C、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase 7、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-PARP的表达均上调,Bcl-2表达下调。3.化合物2y可以显著升高EC109细胞的ROS水平,且呈现剂量依赖性;Western Blotting实验结果显示ROS/JNK通路相关蛋白变化,p-ASK1、p-MKK4、p-JNK、p-c-jun(Ser63)均呈现上升趋势。抗氧化剂NAC可逆转化合物2y对EC109的影响,利用抗氧化剂NAC干预后,几乎完全逆转了化合物2y对于EC109增殖和克隆形成能力的抑制作用。细胞形态也由加药后的皱缩变为正常形态。线粒体膜电位恢复正常,凋亡比例下降。同时逆转了凋亡和活性氧通路相关蛋白的表达变化。4.裸鼠人癌移植瘤模型实验结果表明,化合物2y在裸鼠体内可以抑制肿瘤的生长。其机制是使活性氧通路的蛋白表达升高,导致凋亡相关蛋白变化,最终导致细胞凋亡,体内机制和体外机制一致。肿瘤组织的HE染色结果也进一步证实了化合物2y可以促进肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡。裸鼠体重增长曲线和血液生化指标结果表明,化合物2y对裸鼠体重的影响和对照组(NC)没有明显差异,同时化合物2y对裸鼠的心、肝、脾、肺、肾没有明显毒性,对血常规指标与血液生化指标也没有明显影响。结论1.化合物2y在体外可抑制食管癌细胞的增殖,其机制为通过活化ROS/JNK通路诱导细胞凋亡。2.化合物2y在体内同样抑制肿瘤组织的生长,其分子机制同样是通过活化ROS/JNK通路,促进肿瘤细胞凋亡,与体外机制一致。同时,化合物2y在体内没有表现出明显的毒性。