骨碎补对膝骨性关节炎模型兔滑膜细胞凋亡机制的实验研究

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目的:骨碎补具有补肾强骨、续伤止痛的功效,是祖国医学骨伤科最常用的中药之一,早在宋朝骨碎补就用于治疗“筋骨痹症”,即现代医学的骨性关节炎。本病是以关节的软骨退变为特征的慢性疾患。基于之前骨碎补治疗该病的临床经验、相关医学领域的实验探索,本研究通过TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶)法检测其对兔膝骨性关节炎滑膜细胞凋亡的影响,Western-blot(蛋白印迹)法检测滑膜细胞凋亡Fas、Fasl蛋白因子的不同表达,初步探讨骨碎补对兔膝骨性关节炎滑膜细胞凋亡的作用机理,为临床进一步应用及推广骨碎补,并为新药研发提供依据。材料与方法:将24只新西兰兔随机分为正常组、模型组、骨碎补治疗组、维固力(硫酸氨基葡萄糖)对照组,每组6只实验动物。采用左后肢伸直位管型石膏固定的方法造成膝骨性关节炎的动物模型,固定时间为6周。造模成功后,治疗组按1.5g/Kg/d剂量灌胃给予骨碎补,对照组按7Omg/Kg/d剂量灌胃给予硫酸氨基葡萄糖,模型组和正常组按同等剂量胃饲给予生理盐水。治疗4周后,所有动物用耳缘静脉空气栓塞法处死,取下每只大白兔左后肢膝关节软骨,分离出关节滑膜。一部分固定在福尔马林溶液里,用于HE染色在光镜下观察滑膜细胞形态学改变,TUNEL法检测滑膜细胞凋亡情况;另一部分Western-Blot法检测Fas、Fasl蛋白表达水平。实验数据采用SPSS15.0统计软件实施统计学分析,以P﹤0.05说明有统计学意义。结果:1.兔膝OA模型4周时关节滑膜存在细胞凋亡现象,滑膜组织的凋亡细胞TUNEL染色阳性,在正常关节中仅有弱阳性表达,模型组TUNEL阳性标记的滑膜细胞数量较多,较正常组呈显著增高(P<O.01)。骨碎补治疗组、硫酸氨基葡萄糖对照组TUNEL阳性标记的滑膜细胞数均较多,高于正常组(P<O.01),却显著低于模型组,差异有统计学意义(P<O.01),说明应用骨碎补、硫酸氨基葡萄糖均可减少兔膝骨性关节炎模型滑膜细胞的凋亡。骨碎补治疗组、硫酸氨基葡萄糖对照组组间比较,有明显差异(P<O.01),说明骨碎补减少兔膝骨性关节炎模型滑膜细胞的凋亡作用优于硫酸氨基葡萄糖。2.兔膝OA模型4周时各组关节滑膜的Fas、Fasl蛋白表达水平不尽相同。正常组的Fas、Fas L呈弱表达,模型组的Fas、Fas L呈强表达,两组差异比较有统计学意义(P<O.01)。骨碎补治疗组、硫酸氨基葡萄糖对照组均可以下调兔膝OA模型Fas、Fas L的表达,其蛋白表达水平明显高于正常组(P<O.01),低于模型组(P<O.01)。两组组间比较,差异有显著性,说明骨碎补下调Fas、Fas L的蛋白表达水平强于硫酸氨基葡萄糖。3.造模4周后,关节滑膜出现骨性关节炎的病理改变,骨碎补、硫酸氨基葡萄糖治疗后滑膜超微结构有一点改善,能起到保护作用。结论:1.骨碎补能抑制骨性关节炎滑膜细胞的过度凋亡。2.Fas、Fas L在骨性关节炎滑膜细胞中蛋白表达增强,与其发病机制密切相关。骨碎补能通过下调膝骨性关节炎Fas、Fas L的蛋白表达水平,缓解骨性关节炎滑膜细胞的凋亡。3.骨碎补对膝骨性关节炎滑膜细胞凋亡的效用优于硫酸氨基葡萄糖。
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