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目的:胃癌是一种发病率、死亡率很高的恶性肿瘤,其发生发展是一个多步骤的过程,涉及许多基因的改变。对其机制的研究一直是肿瘤学研究的热点和难点问题。
人类SIOOA4基因定位于1q21,是Ca2+结合蛋白S100家族的成员之一。以往的研究发现SIOOA4在乳腺癌、结直肠癌、食管鳞癌、骨肉瘤、前列腺癌等肿瘤中均呈高表达,且与肿瘤侵袭、转移和患者的预后不良有关。本课题组及其他学者研究证实SIOOA4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。本课题组前期研究表明,应用RNAi抑制SIOOA4基因表达后胃癌细胞凋亡增加、增殖力降低,提示SIOOA4是胃癌发生发展的重要相关基因,但是关于SIOOA4对胃癌细胞体内增殖的影响尚不清楚。另有研究表明,胃癌中SIOOA4表达是治疗后肿瘤复发的重要标志,从临床分子病理学的角度提示SIOOA4可能与顺铂的耐药性有关,但是SIOOA4对顺铂耐药性的影响有待进一步研究。上游基因对其调控的机制也报道甚少。
前期研究表明核糖体蛋白S12在胃癌中高表达,且与胃淋巴结转移密切相关。RNA干扰抑制RPS12基因表达后,胃癌细胞迁移能力明显减弱,而SIOOA4是重要的转移相关基因。我们推测RPS12可能调节SIOOA4影响胃癌细胞转移。
因此我们拟应用RNA干扰抑制SIOOA4表达,观察胃癌细胞对化疗药物顺铂敏感性及对裸鼠移植瘤模型的影响。并初步探讨RPS12基因沉默对SIOOA4表达的影响及其调控机制。本研究将具有重要的科学价值和实际意义。
材料与方法
1、实验材料:胃癌细胞系BGC823(来源于低分化腺癌),细胞培养相关试剂;nu/nu裸小鼠;凋亡双染试剂盒;Western印迹杂交以及PCR相关试剂等。
2、实验方法:用SIOOA4特异性shRNA表达载体及RPS12特异性shRNA表达载体转染胃癌细胞,RT-PCR、Western Blot方法检测SIOO44及相关基因表达;流式细胞仪检测细胞凋亡;MTT检测细胞药物敏感性;荧光色素酶报告系统检测细胞SIOOA4启动子活性;Transwell检测细胞迁移力。
结果:
1、pSIOOA4-shRNA转染后,顺铂对胃癌细胞的半数抑制浓度显著降低,细胞凋亡率增加。说明SIOOA4表达沉默后,胃癌绌胞对顺铂敏感性增加。
2、胃癌裸鼠移植瘤内注射pSIOOA4-shRNA重组质粒后,肿瘤体积显著小于对照组,表明pSIOOA4-shRNA能有效抑制裸鼠移植瘤的生长。
3、SIOOA4表达沉默后胃癌细胞中Phospho-IκB及C-Met表达降低。
4、RPS12表达沉默使胃癌细胞中SIOOA4表达降低;
5、荧光素酶报告基因检测结果显示:RNA干扰抑制RPS12表达后,SIOOA4启动子活性显著低于对照组(p<0.05)。
6、Transwell检测结果表明:pcDNA3.1-SIOOA4转染BGC823/pRPS12-shRNA细胞后,穿过滤膜的细胞数显著高于对照组(p<0.05),说明SIOOA4过表达能回复RPS12表达沉默所致的细胞迁移力降低。
结论:
1、RNA干扰抑制SIOOA4表达后,胃癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性增加,裸鼠移植瘤生长受到抑制,这可能与Phospho-IκB及C-Met表达降低等有关。
2、RPS12在转录水平调控SIOOA4表达而影响胃癌细胞的迁移力。