【摘 要】
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研究目的:病理性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）可以引起胶质细胞激活从而产生异常神经炎症反应,导致神经元损伤死亡。流行病学调查发现,与散发性帕金森病（Parkinson’s disease,PD）患者相比,富含亮氨酸重复激酶2（Leucinerichrepeat kinase2,LRRK2）G2019S突变的PD患者体内具有高水平的寡聚化α-syn（Oligomericα-sy
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研究目的:病理性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）可以引起胶质细胞激活从而产生异常神经炎症反应,导致神经元损伤死亡。流行病学调查发现,与散发性帕金森病（Parkinson’s disease,PD）患者相比,富含亮氨酸重复激酶2（Leucinerichrepeat kinase2,LRRK2）G2019S突变的PD患者体内具有高水平的寡聚化α-syn（Oligomericα-synuclein,O-αS）产生,同时亦存在神经炎症因子增加。然而LRRK2 G2019S调控神经炎症的具体机制尚不清楚。本研究的目的是探讨星形胶质细胞中LRRK2 G2019S突变对O-αS诱导的神经炎症的影响及其机制,进而从神经炎症的角度解读LRRK2 G2019S与PD发生发展之间的关系。研究方法:1、纯化制作α-syn单体蛋白,然后制备成O-αS,并用考马斯亮蓝染色法和免疫印迹（Western blotting,WB）检测α-syn的纯度,通过细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成实验评估O-αS的毒性。2、在野生型或G2019S突变型小鼠纹状体中注射O-αS,6周后通过免疫荧光检测联合Sholl分析评估中脑黑质（Substantia nigra,SN）星形胶质细胞和小胶质细胞的激活、细胞形态变化以及多巴胺（Dopamine,DA）神经元数量变化,以探明LRRK2 G2019S突变对O-αS诱导的神经炎症的影响。3、利用取野生型或G2019S突变型新生小鼠,培养原代星形胶质细胞,通过WB检测原代星形胶质细胞培养3d、7d、14d、21d时LRRK2蛋白的表达,以确定LRRK2蛋白表达是否随时间而变化;O-αS处理24 h后,WB检测炎症相关蛋白变化,ELISA检测细胞培养上清中炎症因子水平变化;免疫荧光与WB检测原代星形胶质细胞内NF-κB信号通路蛋白变化。研究结果:1、免疫荧光结果显示O-αS组SN小胶质细胞和星形胶质细胞数量明显高于CTR组:与O-αS组比,G2019S+O-αS组中小胶质细胞和星形胶质细胞数量亦均有明显增加;Sholl分析结果显示,G2019S+O-αS组与O-αS组相比星形胶质细胞形态发生了明显的变化,表现为胞体增大、分支增多,而小胶质细胞形态G2019S+O-αS组与O-αS组没有明显差异。2、免疫组化结果显示,O-αS组与CTR组相比DA神经元标志物酪氨酸羟化酶（Tyrosine3-monooxygenase,TH）阳性神经元数量没有明显差异,而G2019S+O-αS组与O-αS组相比TH阳性神经元数量减少约20%±4%。3、WB结果显示在培养21天时原代星形胶质细胞LRRK2蛋白表达量最高。O-αS处理24 h后,WB检测发现,G2019S+O-αS组与O-αS组相比NLRP3、Pro-IL-1β表达明显升高;ELISA检测细胞上清中炎症因子,G2019S+O-αS组与αS组相比炎症因子IL-1β、TNF-α水平明显增高,而抗炎因子IL-10水平明显降低。4、给予LRRK2激酶抑制剂IN-1可以明显改变LRRK2G2019S突变对O-αS诱导神经炎症影响,表现为给药以后G2019S+O-αS组炎症水平显著下降。5、O-αS处理24h后,WB结果显示与O-αS组相比,G2019S+O-αS组内NF-κB信号通路相关蛋白（P65、IKK）磷酸化水平增高,IKB蛋白表达减少并转变为促进炎症产生的磷酸化状态;免疫荧光显示G2019S+O-αS组与O-αS组相比P65在细胞核内分布明显增多,表明LRRK2G2019S可能通过NF-κB信号通路调节O-αS诱导星形胶质细胞神经炎症的表达。研究结论:星形胶质细胞中LRRK2 G2019S突变可以通过调节NF-κB信号通路加重O-αS诱导的神经炎症水平,抑制LRRK2激酶活性可能是减轻PD中神经炎症的可行策略。
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