杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国特有的名贵药用树种,叶片、雄蕊、果实、树皮中含有苯丙素类(绿原酸)、黄酮类(槲皮素、山奈酚)、不饱和脂肪酸(α-亚麻酸)、环烯醚萜类、木质素类等活性成分,具有补肝肾、强筋骨、安胎、抗菌消炎、降血压和血脂等作用,广泛应用于医药保健、食品等行业。目前,杜仲育种的重要目标和技术难点是提高这些活性成分的含量,因此,摸清楚杜仲重要成分合成关键酶基因多样性和表达调控规律具有重要作用。本研究以杜仲国审良种‘华中6号’的果实和叶片为实验材料,通过转录组测序和生物信息学分析,发现了绿原酸、α-亚麻酸、槲皮素和山奈酚等4种活性成分合成系列基因的遗传多样性和表达调控规律,通过分析四种物质主要家族成员的cDNA全长理化特性和结构特点,为这4种活性成分高效积累机理的进一步研究提供理论依据。1、获得了“华仲6号”杜仲品种大量表达基因的重要信息及序列：106,264,108个reads、7,491,046,464 Nucleotides (nt).1,316,317个Contig、292,591个Scaffold、185403个Unigene片段；对All-Unigene功能注释分别获得了67,119个、67119个和4,948个CDS、protein和EST的Unigene; GO、COG、KEGG分类分别注释了72,893、42,359、43,715个Unigene,为杜仲次生代谢物积累的分子机理研究奠定了良好的基础。2、杜仲绿原酸合成途径共涉及27条基因,其中幼果和叶片表达量显著差异的基因20条。苯丙氨酸脱氨酶(PAL)是关键酶基因,在杜仲中遗传多样性非常高,基因家族中至少包含12个成员,幼果和叶片均有表达；EuPAL3-EuPAL12基因果实表达量显著高于叶片；叶片以EuPAL1和EuPAL1为主,而果实中多个EuPAL大量表达,调控机制极其复杂；鉴定了EuPAL1全长cDNA,长度2133bp,编码711个aa,分子量77.14 kD,等电点6.24,为稳定的疏水性蛋白,二级结构以a-螺旋和无规卷曲结构为主的混合型结构,隶属lyase-I-like蛋白超家族。杜仲肉桂酸-4-羟化酶(C4H)基因至少包含EuC4H1、EuC4H2两个家族成员,在果实和叶片中均以EuC41高表达为主,果实比叶片分别高105.25倍和6.32倍的显著差异,；鉴定了EuC4H1和EuC4H2全长cDNA分别1641bp和1611bp,编码547和537个aa,分子量分别为62.94 kD和60.96kD,等电点分别为9.34和8.85,均为疏水性不稳定蛋白质,EuC4H2为分泌蛋白,两者均以α-螺旋、β-折叠、无规卷曲结构为主的混合型结构蛋白,隶属Cypx超家族。杜仲香豆酰-CoA连接酶(4CL)基因为多基因家族,至少包含11个家族成员；在幼果和叶片中Eu4CL1、Eu4CL4-Eu4CL6、Eu4CL8基因的表达量具有显著差异,幼果均比叶片高；Eu4CL9-Eu4CL11基因表现为幼果重特异表达；幼果和叶片Eu4CL1-Eu4CL6等6个成员大量表达,表达调控规律极其复杂；Eu4CL1全长cDNA1692bp,编码564个aa,分子量61.94 kD,等电点6.17,亲水性稳定蛋白质,以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲结构为主的混合型结构蛋白质,隶属AFD-class-I超家族；杜仲莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶(HCT)基因至少包括3个成员,叶片和果实均有表达,但仅EuHCT1基因表达量有显著差异；幼果以EuHCT1,叶片以EuHCT1为主；HCT全长cDNA为1338bp,编码446个aa,分子量50.08 kD,等电点9.19,疏水性不稳定蛋白质,形成以α-螺旋和无规卷曲结构为主的混合型二级结构。3、在幼果和成熟果实中获得a-亚麻酸合成相关酶基因13条,差异表达基因6条,叶片和幼果差异表达基因3条；酰基ACP硫脂酶(FatA)基因在幼果和成熟果实表达量无显著差异；杜仲EuFatA基因全长cDNA为1338bp,编码446个aa,分子量为50.59 kD,理论等电点为8.07,主要以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲结构为主的混合型结构的蛋白质,分属于CAP-ED超家族。硬脂酰-ACP去饱和酶(SAD)基因至少由4个家族成员组成,在成熟果实中均有表达,而幼果中只有EuSAD1表达,幼果和成熟果实均以EuSAD1为主；8-12脂肪酸脱氢酶(FAD2)遗传多样性较高,至少由5个家族成员组成,FAD2-1和FAD2-2在幼果和成熟果实中表达量达到显著水平,EuFAD2-1-EuFAD2-3的表达量果实高于叶片,而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果实,调控机理较复杂；杜仲EuFAD2-1基因全长cDNA为993bp,编码331个aa,分子量为38.04 kD,理论等电点为9.26,疏水性的不稳定蛋白质,二级结构中α-螺旋占、β-折叠和无规卷曲结构为主的混合型结构蛋白质,FAD酶家族。omega-3脂肪酸脱氢酶(FAD3)基因至少由6个成员组成,仅有EuFAD3-6表达量有显著差异：成熟果实2/3的基因(EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6)的表达量超过幼果；鉴定EuFAD3基因,其全长cDNA为1278bp,编码426个aa,分子量为49.18 kD,理论等电点为7.43,属于稳定、疏水性的泌蛋白,二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲结构为主的混合型结构蛋白质,FAD酶家族；4、在幼果和成熟叶片中获得槲皮素和山奈酚合成相关酶11条,其中差异表达基因8条；获得查尔酮合酶(CHS)家族成员3个,EuCHS1和EuCHS2在叶片和幼果表达量存在显著差异,叶片EuCHS1的表达量比果实高7.88倍,而EuCHS2果实表达量比叶片高6.56倍,叶片以EuCHS1为主,而果实以EuCHS2为主；EuCHS1, cDNA全长为1191bp,编码397个氨基酸,分子量为43.33 kD,理论等电点为6.23,疏水性稳定蛋白质,二级结构以α-螺旋、β-折叠、无规卷曲结构为主的混合型结构,属cond-enzymes超家族。杜仲查尔酮异构酶EuCHI在叶片和幼果均有表达,但表达量未达到显著水平,获得了1条CHI-like protein,在叶片和幼果表达量有显著差异：杜仲EuCHI, cDNA全长为777bp,编码259个氨基酸,分子量为27.63 kD,等电点为4.81,疏水性稳定蛋白质,EuCHI二级结构以无规卷曲结构、α-螺旋和β-折叠为主的混合型结构的蛋白质,chalone超家族。杜仲黄烷酮3-羟化酶EuF3H在叶片和果实均有表达,但表达量无显著差异；杜仲类黄酮3’-羟化酶EuF3’H在叶片和果实均有表达,但表达量无显著差异；EuF3’H基因其全长cDNA为1551bp,编码517个氨基酸,EuF3’H分子量为56.71kD,理论等电点为8.72,疏水性的稳定蛋白质,分泌蛋白,以α-螺旋和无规卷曲结构为主的混合型二级结构,Cypx超家族蛋白质。杜仲黄酮醇合成酶(FLS)有4成员,EuFLS1-EuFLS4在叶片和幼果均有表达,且均达到显著水平,其中EuFLS3和EuFLS4在叶片中的表达量比幼果分别高出12.98倍和44.24倍,而EuFLS1和EuFLS2果实表达量比叶片分别高出15.38倍和17.65倍,故叶片以EuFLS3和EuFLS4为主,而果实则以EuFLS1和EuFLS2为主。