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血栓可导致脑血管、心脏、肺循环疾病如脑卒中、心肌梗死、肺栓塞等,以冠心病和脑血栓为主的血栓栓塞性疾病的发病率呈逐年上升且年轻化的趋势,严重威胁着人类的生命和健康。在众多的抗栓药物中,氯吡格雷由于具有经济、有效、出血风险低等优势,广泛应用于临床。然而因抵抗、生物利用度低、受药物相互作用影响大的原因,其弊端日益突出。针对氯吡格雷的上述问题,我们课题组前期设计并合成了氘代氯吡格雷,前期氘代氯吡格雷在大鼠全血中消除速率实验提示:对氯吡格雷进行氘代,可明显提高药物对酯酶的稳定性,降低甲酯水解速率,延缓药物在体内分解过程。另外前期大鼠单次给药量效关系实验研究显示:大鼠单次灌胃给药4h后,氘代氯吡格雷具有显著的抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用,且无延长出血风险趋势。本研究拟在此工作基础上,按照临床给药方案,开展氘代氯吡格雷多次给药的药代动力学、抗血小板作用及其机制研究。具体研究内容如下:一、分子对接研究氘代氯吡格雷与羧酸酯酶1、P2Y12受体结合能的变化研究方法:应用Autodock软件,将氯吡格雷、氘代氯吡格雷及其活性代谢产物分别与羧酸酯酶1、P2Y12受体进行对接分析,拟在理论水平分析氘代可能带来的收益。研究结果:氘代可以降低药物与羧酸酯酶1的结合能力,增强与P2Y12受体的结合。由此推断,氘代后无活性产物氯吡格雷酸的生成可能会减少,而活性代谢产物的生成可能会增加,氘代具有增强氯吡格雷抗血小板作用的潜力。二、氘代氯吡格雷药代动力学特性变化通过药代动力学研究对上述理论结果进行验证。研究方法:将实验大鼠随机分为氯吡格雷组、氘代氯吡格雷组。模拟临床给药方案,负荷剂量40mg/kg灌胃给药1天,维持剂量10mg/kg灌胃给药6天。采集末次给药前及给药后不同时间点抗凝全血,HPLC-MS/MS法测定氘代氯吡格雷衍生化活性代谢产物及氯吡格雷酸水平,考察氘代氯吡格雷相对于氯吡格雷代谢途径存在的优势。制备大鼠肝微粒体,利用“Cocktail法”测定CYP450酶活性、“PNPA底物法”测定羧酸酯酶1活性,基于酶学机制探索氘代氯吡格雷代谢变化原因。研究结果:氘代氯吡格雷可以明显增加活性代谢产物的体内暴露量,减少氯吡格雷酸的生成,有助于提高氯吡格雷的生物利用度。其机制与氘代氯吡格雷减弱对主要活化代谢酶CYP2C19、CYP3A4等的抑制作用有关。三、氘代氯吡格雷抗血小板作用及机制研究既然与氯吡格雷比较,氘代氯吡格雷具有更优的药代动力学特性,那么其抗血小板作用效果如何呢?本部分研究将对氘代氯吡格雷抗血小板作用及其机制进行深入研究。为了预防氯吡格雷引起的胃肠道损害事件,临床常联合应用质子泵抑制剂奥美拉唑,但由于二者存在严重的药物相互作用,FDA已发布二者联合用药的警告。所以,我们设计了奥美拉唑联合用药实验,以考察两药联合应用对氘代氯吡格雷药代动力学、抗血小板作用的影响。研究方法:1)采用比浊法、ELISA法、流式细胞术检测氘代氯吡格雷对血小板聚集功能、血小板颗粒释放功能的影响,评价氘代氯吡格雷的抗血小板作用;2)利用透射电子显微镜观察血小板形态及内部颗粒储存状态,评价氘代氯吡格雷对血小板活化的影响;3)建立大鼠电刺激血栓模型,评价氘代氯吡格雷抗血栓形成作用;4)利用4D Label-free蛋白质组学技术对血小板蛋白质组进行检测,找到差异蛋白。通过对差异蛋白进行GO分析、KOG分析、功能富集分析、KEGG信号通路分析,探索氘代氯吡格雷抗血小板作用的靶点及机制;5)LC-MS/MS法测定氘代氯吡格雷联合用药组衍生化活性代谢产物生成量,并测定CYP450酶活性,考察联合用药对氘代氯吡格雷代谢的影响;6)采用比浊法测定联合用药后血小板聚集率的变化、建立大鼠电刺激血栓模型测定联合用药后的血栓长度、应用血栓弹力图仪考察联合用药对血栓形成过程的影响,综合评价联合用药对氘代氯吡格雷抗血小板、抗血栓形成的影响。研究结果:1)与氯吡格雷比较,氘代氯吡格雷对血小板聚集、颗粒释放以及活化的抑制效果更佳,因此,表现出更显著的抗血栓形成作用;2)氘代氯吡格雷治疗组可影响众多与血小板活化、骨架伸缩、颗粒释放功能相关蛋白的表达,氘代氯吡格雷通过抑制血小板内P2Y12-c AMP-VASP/P-VASP-PAC-1信号通路、及与颗粒释放相关的SNARE-SNAP-23-VAMP-8通路发挥抗血小板作用;3)与氯吡格雷联合用药组比较,氘代氯吡格雷联合用药组药代参数受奥美拉唑影响较小、对CYP450酶活性的抑制作用更弱、抑制血小板聚集能力更强、抗血栓形成作用更好,提示氘代氯吡格雷具有受药物-药物相互作用影响小的优势。四、氘代氯吡格雷对血液系统及肝脏组织影响研究对于长期应用抗栓类药物来预防和治疗血栓性疾病的患者而言,其机体的凝血功能等指标很可能会出现异常。以氯吡格雷为代表的P2Y12受体拮抗剂主要经过肝脏代谢,那么药物的原形、代谢的中间产物或终产物都有可能对肝脏造成一定程度的损伤。因此,本章将对血常规、凝血四项、肝功能、肝脏组织、肝细胞凋亡等指标进行检测,考察氘代氯吡格雷对血液系统及肝脏组织的影响。研究方法:1)利用血细胞分析仪、凝血分析仪检测氘代氯吡格雷对血常规、凝血四项指标的影响;2)利用生化分析仪、H＆E染色、流式细胞仪及免疫组化技术检测氘代氯吡格雷对肝功能、肝脏组织、肝细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达水平的影响,考察氘代氯吡格雷对肝脏组织的影响。研究结果:氘代氯吡格雷对血液系统、肝功能、肝脏组织均无影响。虽然氘代氯吡格雷可使肝细胞发生凋亡,但与氯吡格雷比较,氘代氯吡格雷诱导的肝细胞凋亡较弱,可能与氘代氯吡格雷下调促凋亡蛋白Bax,Caspase-3的表达有关。