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[目的]通过建立体外血脑屏障模型研究非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)在脑转移过程中血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)脑微血管内皮细胞(b.End3)内Epsin2及相关因子VEGFR 2、VE-cadherin、Occludin和Z0-1的表达变化,并使用化学合成的siRNA(small interfering RNA)干扰b.End3的Epsin2表达后,研究Epsin2对体外血脑屏障功能及相关因子表达的影响,为NSCLC脑转移过程提供新的理论依据及潜在的治疗方向。[方法]1.采用单层小鼠脑微血管内皮细胞b.End3建立体外血脑屏障模型(Blood-Brain Barrier Model,BBBM);采用单层小鼠脑微血管内皮细胞b.End3与人非小细胞肺癌细胞A549建立非接触共培养血瘤屏障模型(Blood-Tumor Barrier Model,BTBM);2.体外BBBM及BTBM建模成功后,使用跨膜内皮电阻仪分别测量上述两种模型的跨膜内皮电阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)并记录其变化趋势,提取培养5天后的BBBM及BTBM中b.End3细胞,分别使用离心柱法提取总RNA,分别使用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)、qPCR(quantitative real-time PCR)的方法检测 Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin、ZO-1、Occludin的蛋白表达水平与mRNA水平的变化。3.使用化学合成的siRNA干扰b.End3细胞Epsin2的表达,然后使用IF、WB与 qPCR 的方法检测正常 b.End3 与 Epsin2 siRNA b.End3 中 Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin、ZO-1、Occludin 的蛋白表达与 mRNA 的变化。4.使用Epsin2 siRNA b.End3细胞建立体外BBBM作为实验组,正常b.End3细胞建立体外BBBM作为正常组。建模成功后继续共培养5天,检测正常组与实验组TEER变化及A549细胞侵袭移能力的变化。[结果]1.体外BBBM与BTBM的检测;1.1跨膜内皮细胞电阻检测:BBBM和BTBM的TEER值在前2天缓慢上升,第1天两组间比较无显著差异(P>0.05),第2天BBBM的TEER上升幅度大于BTBM,差异有统计学意义(P<0.05)。第3天BBBM组TEER继续上升,但BTBM开始下降,差异有统计学意义。第4天及第5天两组TEER均下降,差异有统计学意义(p<0.05)。1.2 IF结果:免疫荧光结果显示,与BBBM组的b.End3相比,BTBM中的b.End3中的Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin 的表达升高,ZO-1、Occludin 表达量下降,差异有统计学意义(p<0.05)。1.3 qPCR 结果:与 BBBM 组 b.End3 相比,BTBM 中 b.End3 中的 Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin的mRNA表达量升高,ZO-1、Occludin表达量下降,差异有统计学意义(p<0.05)。2.b.End3转染化学合成Epsin2 siRNA干扰Epsin2后的检测:2.1 IF结果:免疫荧光结果显示,与正常b.End3相比,Epsin2 siRNA b.End3中的Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin的表达降低,ZO-1、Occludin表达有所升高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.2 qPCR 结果:与正常 b.End3 相比,Epsin2 siRNA b.End3 中的 Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin的mRNA表达量降低,ZO-1、Occludin表达量上升,差异均有统计学意义(p<0.05)。2.3 WB结果与正常 b.End3 相比,Epsin2 siRNA b.End3 中 Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin的蛋白表达量降低,ZO-1、Occludin表达上升,表达差异均有统计学意义(p<0.05)。3.培养第1天正常组BBBM的TEER稍低于实验组,但差异无统计学意义(P>0.05),之后四天实验组BBBM均高于正常组,均有统计学意义(P<0.05)。4.A549细胞侵袭实验结果:实验组平均穿膜细胞数明显减少于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.使用单层b.End3与A549细胞可以成功构建体外BBBM与BTBM。2.A549 与 b.End3 非接触共培养后,Epsin2、VEGFR2、VE-cadherin 的表达量上升,紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的表达量下降,BBB功能被破坏。说明NSCLC脑转移后,Epsin2及其下游因子VEGFR2、VE-cadherin表达量的上升以及紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的表达量的下降可能引起脑微血管内皮细胞通透性增加,从而破坏血脑屏障完整性,进而有利于NSCLC脑转移的发生。3.干扰b.End3细胞的Epsin2表达后,VEGFR2、VE-cadherin的表达也随之降低,ZO-1、Occludin 的表达升高,证明了 Epsin2-VEGFR2-VECadherin 之间存在上下游的调控关系,而Epsin2也有可能通过VEGFR2的作用调控Z0-1的表达。4.成功使用 siRNA 干扰 b.End3 中 Epsin2 的表达后,VEGFR2、VE-cadherin表达量也随之下降,BBB功能破坏减轻,紧密连接蛋白ZO-1及Occludin表达量上升。Epsin2 siRNA b.End3构建的的BBBM的TEER高于正常内皮组成的BBBM,说明前者的BBBM完整性高于后者。且A549在转染后内皮细胞组成的BBBM中对BBB的侵袭能力也大幅下降,提示b.End3中Epsin2的缺失可能抑制a549细胞对体外血脑屏障的侵袭能力。