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授粉是植物进行有性生殖的关键环节,是种子和果实产生的基础。花粉和柱头细胞的识别是植物授粉识别的关键步骤。落在柱头上的花粉经历黏附、水合、萌发等过程,生长出花粉管将精细胞转移到胚囊完成双受精。我们在前期的研究中鉴定到一个拟南芥kinβγ突变体,该突变体花粉能够在体外正常萌发,但是在柱头上的粘附异常,不能在柱头上萌发。KINβγ是植物非酵解型蔗糖激酶1复合体(Sucrose Nonfermenting RelatedProtein Kinase1 complex,SnRK1 complex)的一个调节亚基。SnRK1 complex是糖信号转导过程中的关键因子,主要参与了代谢调控、激素和发育信号转导的调节。 本研究以拟南芥KINβγ基因的T-DNA插入突变体为材料,分析了KINβγ调控花粉在柱头上萌发的分子机制。我们利用pKINβγ∷KINβγ-G US和pKINβγ∷KINβγ-YFP的转基因植株对该蛋白在花粉中的表达模式和亚细胞定位进行了详细地观察,发现KINβγ在花粉减数分裂过程及四分体中有表达,在成熟的花粉粒及花粉管中主要定位在营养核中,在细胞质中也有较少的分布。 由于kinβγ突变体不能获得纯合体,以下的研究都是利用杂合体进行的。人工授粉实验发现部分杂合突变体的花粉不能在野生型柱头上完成水合。电子显微镜观察发现部分突变体花粉外形有凹陷,突变体花粉内部小泡数量增多、体积变大。突变体花粉的线粒体膜和脊结构模糊,DAB染色之后的透射电镜结果显示过氧化物酶体形状出现异常;我们利用线粒体的marker DIPS-RFP/GFP、线粒体荧光标记染料Mito-Tracker RED以及过氧化物酶体的marker mCherry-PTS1分别标记花粉的线粒体及过氧化物酶体,发现突变体花粉的线粒体及过氧化物酶体的数量减少。RNAseq分析表明,kinβγ/+花粉中多个参与调控线粒体及过氧化物酶体发生及分裂基因的表达量与野生型相比有明显差异。CM-H2DCFDA染料标记活性氧后发现突变体花粉粒内部活性氧水平降低。体外施加过氧化氢可以部分补偿突变体花粉的水合能力,由此我们推测活性氧对于花粉的水合非常重要。突变体花粉在柱头上的水合能力下降,可能是造成花粉不能在柱头上萌发的原因。综合上述结果,我们推测KINβγ基因在花粉中通过调控线粒体及过氧化物酶体的发生及分裂来调节花粉内的活性氧水平,进而介导花粉在柱头上的黏附和水合,调节花粉在柱头上的萌发。 为了进一步验证KINβγ是否通过SnRK1复合体发挥功能,我们利用artificialmicroRNA interference技术构建了能同时沉默编码SnRK1 complex中α亚基基因KIN0、KIN11的RNAi载体,转化拟南芥。研究发现,转基因植株的表型与kinβγ突变体的极为相似,包括花粉外形异常、花粉线粒体数量减少等。我们推测KINβγ是通过参与形成SnRK1复合体,而调控花粉在柱头上的萌发。