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新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的急性、高度接触性的禽类传染病，给世界养禽业造成极大的经济损失。目前，疫苗接种仍然是预防和控制该病普遍采用的方法。NDV4是广泛应用于东南亚和非洲等热带亚热带地区的一种耐热疫苗株，具有耐热性和免疫持续期长等优点。NDV4-C株是V4疫苗株在SPF鸡胚上连续传代筛选获得的一株耐热无毒株，目前NDV4毒株的研究相对滞后，一个主要的原因是反向遗传操作系统平台尚未建立，相应的耐热性和免疫原性研究也鲜有报道。为此，本研究以NDV4-C株为研究对象，在对NDV4-C株全基因组序列系统解析的基础上，首次建立了分别以T7启动子和CMV启动子的NDV4-C株反向遗传操作系统，拯救病毒rNDV4-C （T7）和rNDV4-C （CMV）的耐热性和生物学特性均与亲本毒株相似。同时，为了评估NDV4-C株作为载体的可行性，构建了表达增强型绿色荧光蛋白的重组新城疫病毒rNDV4-eGFP，其在SPF鸡胚上生长特性与亲本病毒相似，重组病毒能够稳定表达增强型绿色荧光蛋白至少15代，结果表明，rNDV4-C具有作为病毒载体应用的潜力。聚合酶蛋白对副粘病毒的耐热性作用已有报道，为了调查聚合酶蛋白对NDV4-C株耐热性的作用影响，我们分别构建了以耐热株NDV4-C和不耐热株LaSota为骨架替换聚合酶基因的嵌合病毒株rNDV4-La-L和rLaSota-V4-L，测定其耐热性和病毒生物学特性，结果表明以NDV4-C为骨架的嵌合病毒耐热性降低，生长滴度低于NDV4-C株的生长滴度。反之，以LaSota为骨架嵌合NDV4-C株聚合酶基因的嵌合病毒耐热性有一定程度的提高，生长滴度也较LaSota的滴度升高。此外，用表达荧光素酶的微基因组系统检测聚合酶蛋白活性，结果表明NDV4-C株的聚合酶蛋白具有更高的活性。因此聚合酶蛋白影响了NDV4-C的耐热性。当前的NDV疫苗免疫可有效控制新城疫疫情，但不能够阻止新城疫病毒的排毒、传播和感染。V4疫苗株与LaSota、Clone30和Hitchner B1等疫苗株相比，免疫诱导的体液免疫抗体水平低，但粘膜免疫水平较高。为了探讨能否在保持NDV4-C耐热性的基础上提高其免疫应答水平，在前两项工作的基础上，我们构建并拯救了以NDV4-C为骨架嵌合当前流行的基因Ⅶ型强毒株Go/CH/HLJ/LL01/08（LL01/08）囊膜蛋白的两株嵌合病毒rNDV4-HNLL01和rNDV4-MuF/HNLL01。相对于亲本病毒LL01/08，嵌合病毒保持了低毒力，生长略有延迟，耐热性略有下降但保持了耐热性。病毒株rNDV4-C、rNDV4-HNLL01、rNDV4-MuF/HNLL01和疫苗株LaSota以1×106EID50剂量滴鼻免疫两周龄SPF鸡，能够诱导不同程度的体液免疫和粘膜免疫水平，免疫两周后以1×106EID50的剂量强毒株LL01/08攻毒。动物实验结果表明，嵌合病毒诱导产生的IgG抗体水平并没有升高，但在血清和十二指肠产生的IgA抗体水平较亲本病毒rNDV4-C显著提高。嵌合病毒能够完全保护SPF鸡抵抗致死剂量强毒的攻击，更重要地是嵌合病毒rNDV4-MuF/HNLL01免疫组的排毒量较NDV4-C免疫组有显著的下降。结果表明嵌合病毒rNDV4-MuF/HNLL01能够作为防控当前流行NDV的候选疫苗株。