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百合是世界著名的五大切花之一,其花朵硕大,色彩各异,姿态优雅,芳香浓郁,倍受人们喜爱。全世界切花百合的每年销量数以亿计。但是,百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放迅速衰老,如何延长百合花朵的寿命已成为近年来专家们研究的主要课题之一。在百合切花衰老机理研究的基础上,克隆百合ACC 氧化酶基因cDNA,构建其反义表达载体,进一步转入百合体细胞中表达,通过这种调控百合中乙烯表达的方法来控制百合的衰老,以达到延长百合花期的目的。 本研究以亚洲百合杂种‘Pollyanna’和东方百合杂种‘Sorbonne’为试料,提取花瓣组织总RNA,通过特异引物RT-PCR,克隆得到百合ACC 氧化酶基因的cDNA 片段,并将此序列反向插入到高效植物表达载体中,构建百合ACC 氧化酶基因反义表达载体,为进一步的基因转化研究奠定基础。本研究取得的主要成果是: 1. 建立适合于百合花瓣总RNA 提取的改进CTAB-LiCl 法。在比较异硫氰酸胍法、SDS/酚法与CTAB-LiCl 法提取总RNA 效果的基础上,针对百合组织中富含多糖的特点,在Sorbonne 提取RNA 中加入特殊除多糖步骤,改进了CTAB-LiCl 法。结果表明,改进CTAB-LiCl 法能有效去除多糖,提取到的RNA 28S rRNA 亮度约为18S rRNA 的2 倍,A260/280 介于1.8-2.0 之间,A260/230 为2.0, Pollyanna RNA 产率为36.3 μg·g-1,Sorbonne RNA 产率为10.2μg·g-1。 2. 获得百合ACC 氧化酶基因cDNA 片段。以东方百合‘Sorbonne’和亚洲百合‘Pollyanna’的花瓣为材料,提取并纯化总RNA;经反转录合成cDNA;根据其它植物中ACC 氧化酶基因的保守序列,设计合成一对简并引物;经PCR 扩增、克隆得到东方百合‘Sorbonne’和亚洲百合‘Pollyanna’的ACC 氧化酶基因片段各两个;登录GenBank,登录号分别为:OHS-1,AY656735;OHS-2,DQ062133;AHP-1,AY656736;AHP-2,DQ062134。 3. 构建亚洲百合ACC 氧化酶基因片段反义表达载体。在亚洲百合‘Pollyanna’ACC氧化酶基因片段AHP-2 的两端通过再次克隆引入BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点,得到亚