人工关节感染(PJI)是人工关节置换术后最严重的并发症之一,PJI需要多次手术和长时间抗生素治疗,给患者和社会带来严重负担。及时、准确的微生物诊断是PJI治疗成功的关键。由于微生物在假体表面形成生物膜、浮游菌量少、微生物培养困难以及采样使用抗生素等原因,传统的微生物培养方法对病原微生物检出的阳性率低,且培养时间较长。临床常用的广谱的微生物分子诊断方法包括宽泛围PCR(BR-PCR)和宏基因组二代测序(mNGS),可不依赖培养、快速检出PJI标本中的病原微生物。这两种方法对关节液、假体周围组织及超声裂解液中病原微生物检出能力以及对PJI的诊断价值如何仍未明确。第一章宽泛围PCR方法对人工关节感染的微生物诊断价值【目的】研究宽泛围PCR(BR-PCR)方法对人工关节感染(PJI)患者关节液、假体周围组织和超声裂解液标本中的病原菌检出能力和对PJI的诊断价值。【方法】回顾性纳入人工关节翻修患者67例,分为PJI组和无菌性失败(AF)组。采样前均停用抗生素2周以上,每例患者均采集关节液、假体周围组织以及取出的假体的超声裂解液,所有标本类型均分别行微生物培养和BR-PCR,BRPCR扩增产物使用Sanger测序和BLAST比对。比较各种方法微生物检出结果的一致性和对PJI的诊断敏感性与特异性。【结果】纳入PJI组53例,AF组14例。所有标本中共培养出53株病原微生物,BR-PCR共检出47株细菌,BR-PCR未能检出多重微生物及真菌。超声裂解液培养、关节液PCR和超声裂解液PCR对PJI诊断敏感度分别为83.0%、83.0%和84.9%,三者之间差别无统计学意义(P>0.05),但均显著高于关节液培养(69.8%)、假体周围组织培养(71.7%)以及假体周围组织PCR(34.0%)(P<0.05)。关节液培养、假体周围组织培养、超声裂解液培养、关节液PCR、假体周围组织PCR和超声裂解液PCR的诊断特异度则无显著差别(P>0.05)。【结论】BR-PCR方法检测关节液、超声裂解液诊断PJI的敏感性高,但未优于培养方法检测超声裂解液。而且BR-PCR方法会漏检真菌或多重感染标本中的细菌,且BR-PCR方法存在假阳性可能,需审慎解读检测结果。由于诊断敏感度低,假体周围组织标本不适合用于BR-PCR检测。第二章宏基因组二代测序方法在人工关节感染微生物诊断中的应用第一部分宏基因组二代测序方法检测关节液对人工关节感染的微生物诊断价值【目的】研究宏基因组二代测序方法(mNGS)对人工关节感染(PJI)患者关节液中病原微生物的检出能力和对PJI的诊断价值。【方法】前瞻性纳入人工关节置换术后行翻修或清创手术的患者共70例,其中PJI组49例和无菌性失败(AF)组21例。同期纳入10例初次关节置换(PTJA)患者作为阴性对照组。采集关节液、假体周围组织和超声裂解液用于微生物培养,采集关节液用于mNGS检测。分析mNGS检测结果,计算属水平相对丰度(RAG)的筛选阈值,比较mNGS检测结果与微生物培养结果的一致性,比较不同微生物检测方法对PJI的诊断敏感性与特异性。【结果】以细菌RAG>15%和真菌RAG>30%为mNGS结果的筛选阈值。39例培养阳性的PJI病例中,37例(94.9%)mNGS检测阳性,其中在种水平上完全一致的27例(73%)、在属水平上完全一致的32例(86.5%)、部分一致的4例(10.8%),完全不一致的1例(2.9%)。mNGS可从5例培养阳性PJI病例中检出未培养出的病原微生物。mNGS可从所有10例培养阴性的PJI病例中检出病原微生物。在6例培养阳性PJI和1例AF病例中,mNGS未能检出8种培养阳性的病原微生物。取材前2周内使用抗生素的病例中,mNGS检测阳性率为94.4%,显著高于关节液培养(20.7%,P<0.01)和综合培养结果(61.1%,P<0.05)。PTJA组所有10例病例的培养和mNGS检测结果均为阴性。mNGS方法诊断PJI的敏感度为95.9%,高于关节液培养(61.2%)和综合培养(79.6%),差别有统计学意义(P<0.05);mNGS、关节液培养和综合培养方法对PJI的诊断特异度无显著性差别(P>0.05)。【结论】mNGS方法能够有效地检出PJI患者关节液中的病原微生物,特别是对于取样前接受抗生素治疗导致培养阴性的PJI病例,还可从培养阳性PJI病例中检出更多的病原微生物。mNGS有较高的PJI诊断特异性和敏感性,可作为培养方法的有效补充。第二部分宽泛围PCR和宏基因组二代测序方法对人工关节感染微生物诊断价值的比较【目的】比较宽泛围PCR(BR-PCR)和宏基因组二代测序(mNGS)方法对人工关节感染(PJI)关节液中的微生物检出的一致性以及对PJI的诊断价值,明确BR-PCR能否作为mNGS检测的验证方法。【方法】前瞻性纳入第二章第一部分患者,排除关节液量过少或PCR反应受抑制的患者,分为PJI组45例和无菌性失败(AF)组18例。关节液同时分别行mNGS和BR-PCR检测。比较mNGS方法和BR-PCR方法从关节液中检出微生物的一致性以及对PJI的诊断价值。【结果】以检测阳性为标准,BR-PCR方法与mNGS方法的一致性一般(kappa值为0.675)。2例mNGS检出多种病原微生物的病例,BR-PCR仅检出1种病原菌;8例mNGS检测出病原菌但BR-PCR检测阴性,其中4例培养及mNGS均检出真菌;2例BR-PCR检出病原菌但mNGS检测阴性。36例mNGS与BR-PCR检测均阳性的病例中,BR-PCR鉴定至属水平17例,其中与mNGS一致的15例;BR-PCR鉴定至种水平18例,其中与mNGS一致的15例;BR-PCR鉴定失败1例。10例培养阴性的PJI标本中,mNGS均检出细菌,而BR-PCR漏检3例。BR-PCR方法检测关节液的敏感度为82.2%,低于mNGS方法(95.6%),但差别无统计学意义(P>0.05)。两种方法的特异度均为94.4%,无明显差别(P>0.05)。【结论】相对于BR-PCR方法,mNGS方法可从PJI关节液中检出更多的病原微生物。由于与mNGS检测结果的一致性以及微生物检出阳性率均不够高,针对16S r RNA的BR-PCR方法不能作为验证关节液mNGS检测结果的常规方法。对于培养阴性但临床高度怀疑PJI的病例,若有条件应优先选择mNGS作为分子诊断方法。第三部分宏基因组二代测序方法检测超声裂解液对人工关节感染的微生物诊断价值【目的】研究宏基因组二代测序方法(mNGS)检测超声裂解液对人工关节感染(PJI)患者病原微生物的检出能力和对PJI的诊断价值。【方法】前瞻性纳入接受人工关节翻修手术的35例患者,分为PJI组20例和无菌性松动(AF)组15例。采集关节液及取出假体的超声裂解液,分别行mNGS检测。同期纳入3例初次人工关节置换患者的关节液行超声裂解处理,作为阴性对照组。比较超声裂解液mNGS检测结果与关节液mNGS及微生物培养结果的一致性,以及对PJI的诊断敏感性与特异性。【结果】计算筛选阈值:关节液和超声裂解液的细菌属水平相对丰度(RAG)分别为15%和30%,真菌的RAG均为30%。13例培养阳性的PJI病例中,12例关节液mNGS阳性,其中7例与培养结果在种水平完全一致,1例在属水平一致;13例超声裂解液mNGS阳性,其中9例与培养结果在种水平完全一致,1例在属水平一致。7例培养阴性的PJI病例中,其中有6例关节液与超声裂解液mNGS均阳性,且在种水平一致;1例仅超声裂解液mNGS阳性。15例AF病例中,培养及关节液mNGS均阴性,仅1例超声裂解液mNGS阳性。3例阴性对照关节液、超声裂解液的培养及mNGS均为阴性结果。所有病例中,mNGS在超声裂解液中共检出24种病原菌,关节液中检出22种。超声裂解液mNGS的微生物reads数量、病原菌种水平严格比对reads数量明显高于关节液mNGS(P<0.001)。超声裂解液mNGS和关节液mNGS对PJI的诊断敏感度无明显差别(分别为90.0%和100.0%),但均显著高于关节液培养、组织培养和超声裂解液培养(分别为40.0%、60.0%和65.0%,P<0.05)。各种微生物检测方法特异度之间无明显差别(P>0.05)。【结论】使用mNGS检测人工关节翻修患者的超声裂解液可准确诊断PJI和检出标本中的病原微生物;相比关节液,mNGS可从超声裂解液中检出更多的病原微生物及更高的reads数量。mNGS检测关节液已可满足大部分PJI病例的临床和病原诊断需要,部分疑难病例可采用mNGS检测超声裂解液。