在中国水产养殖业高速发展的同时,各类水产病害亦迅速增加,药物防治作为中国水产动物疾病防治的主要方式,其安全性已经引起了社会的普遍关注。而要保证水产养殖动物及养殖生态环境的安全,就必须重视渔药的安全性评估。γ-氨基丁酸(GABA)作为机体中枢神经系统主要的抑制性神经递质,其神经调节功能主要通过GABA受体(GABA R)起作用。根据药理特性的不同,可将GABA受体分为GABA A R、GABA B R和GABA C R三种类型,其中A型受体是最主要的受体,在动物界有广泛分布。该受体上除了GABA及其抑制剂荷包牡丹碱亲和位点外,还存在其他3种GABA激动剂、拮抗剂的结合位点(苯二氮卓位点;巴比妥盐位点;抑制剂苦毒宁和TBPS(t-Butylcyclophosphorothionate)位点),它们可直接或间接影响GABA与GABA A受体的亲和力,亦或增加或降低氯离子通道开放频率,进而影响中枢神经系统的抑制性神经调节功能。目前有关GABA和GABA A受体的研究还主要集中在哺乳动物相关疾病的病理和药理研究,以及新型农用杀虫剂的研发,而在水产养殖中的研究还很少。然而阿维菌素、氟喹诺酮类、有机氯类药物亦可用于水产动物疾病的防治过程中,这些药物在作用于病原体的同时,亦可作用于非靶动物即养殖动物体内的药物受体,进而给养殖动物亦造成了不可忽视的伤害。到目前为止,前人的研究多是集中于探究药物作用后对GABA含量、GABA与受体亲和力、氯离子开放频率的影响,很少涉及GABA受体含量的变化。而以药物受体研究药物影响及其安全性具有针对性、特异性的优势,因此,本研究以GABA A受体作为检测指标,克隆异育银鲫体内的GABA A受体亚基,并采用荧光定量PCR、Western blot蛋白印记和免疫组织化学染色对健康异育银鲫体内GABA A受体在表达模式进行分析,最后对双氟沙星(DIF)作用后GABA A受体基因和蛋白表达的变化进行研究,从而评估双氟沙星对异育银鲫的安全性,为推进中国渔药安全性评估体系建设具有一定的理论指导意义,有利于提高中国水产养殖过程中渔药的安全使用,推动水产养殖业的可持续发展。本论文的主要研究及结果如下:(1)采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)法克隆得到了异育银鲫GABA A受体γ2亚基基因全长c DNA,并进行了生物信息学分析。该基因长2763bp,其中CDS区长1437 bp,可编码477个氨基酸的前体蛋白。预测蛋白分子量55.3 k D,理论等电点9.13。异育银鲫体内GABA-A受体γ2亚基氨基酸序列N端存在1个长度为35个氨基酸的信号肽,4个长度分别为23、20、23和23个氨基酸的跨膜区,3个N-糖基结合位点和2个O-糖基化位点,1个特异性结构域,其氨基酸序列具有明显的氯离子门控通道家族特征。氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性都在89%以上,表明该蛋白属于GABA A受体亚基家族。系统进化树表明异育银鲫与斑马鱼聚为一支,亲缘关系最近。(2)采用荧光定量PCR、Western blot蛋白印迹和免疫组织化学染色法研究了GABA A受体在健康异育银鲫体内组织特异性分布情况。荧光定量结果显示,GABA A受体在脑、肝、肾、心、肌肉、肠、皮、性腺中均有表达,且各组织中表达量差异显著(P<0.05)。其中尤以脑组织中含量最高,性腺和肝脏次之,前肠、肾脏、肌肉、心脏、表皮中的表达量依次降低。Western blot蛋白印迹结果显示GABA A受体蛋白在各组织中均有表达,其中仍以中枢神经系统中的含量最多,性腺次之,肝脏、肾脏、前肠、肌肉、心脏表达水平依次降低,在皮中表达量最低。统计学分析显示GABA A受体γ2亚基蛋白在各组织间表达量差异显著(P<0.05)。通过免疫组织化学染色发现GABA A受体在脑、肝、肾中的分布仍以脑内最多,密度分析发现在肝脏、肾脏、端脑、延脑、中脑、小脑内的GABA A受体密度依次增加。其中,在端脑内GABA A受体主要分布于纹状体区域;中脑内主要分布于视盖区域;小脑的分子层和蒲氏细胞层分布较多,而在颗粒层分布较少,此外伸入视叶内的小脑瓣也有大量阳性颗粒存在;在延脑(即迷走叶)内主要分布在粗颗粒层即内层,而在颗粒层(外层)分布较少;在肝脏内GABA A受体均匀分布在肝细胞膜上;肾脏内则集中分布于肾小管细胞的细胞膜上。(3)采用荧光定量PCR和Western blot蛋白印迹技术研究了双氟沙星处理后的异育银鲫的脑、肝脏、肾脏、肌肉、性腺5种组织中GABA A受体基因水平和蛋白表达水平的变化情况。实验结果表明GABA A受体在上述5种组织中基因和蛋白表达水平上均降低,其中基因水平降低更快、更显著;蛋白表达水平的降低具有一定的滞后性。此外在所有测试的组织中,双氟沙星对脑组织内GABA A受体含量的抑制效果最显著,且具有持久性,即恢复到原有水平需经过一段较长的代谢周期。因此,本次实验研究的结果说明双氟沙星可显著抑制GABA A受体的表达,对水生动物各组织均具有一定的神经毒性作用,对神经系统的毒性最显著。综上所述,在异育银鲫体内存在GABA A受体,且由γ2亚基构成的GABA A受体在异育银鲫的中枢神经系统和外周组织均有分布,但主要分布于中枢神经系统,在性腺中的表达量也较高。双氟沙星处理后,脑、肝脏、肾脏、肌肉和性腺中GABA A受体的含量均有不同程度的降低,最显著的降低见于脑组织。因此,双氟沙星对水生动物各组织均具有一定的神经毒性作用,对神经系统的毒性最显著。本研究为GABA受体在水产养殖领域的研究及在渔药安全性评估中的应用提供了一定的实验基础和理论基础。