临床研究表明胆汁淤积性肝脏疾病往往伴随有血浆内源性阿片肽水平的升高。在胆道梗阻患者和动物模型的报道中，血浆内源性甲硫氨酸脑啡肽的水平可升高至正常值的二到六倍。升高的内源性阿片肽不仅会损害心血管、肝、肾功能，还可诱发剧烈的皮肤瘙痒等副反应。在本课题组以前的研究中，我们还发现，阻塞性黄疸患者术中地氟醚、异氟醚和瑞芬太尼等的需求量较非黄疸患者显著降低，提示上调的内源性阿片肽水平可能也介导了黄疸患者基础痛阈值的升高。然而，关于阻塞性黄疸患者内源性阿片类物质合成增加的机制仍不明确。最近对黄疸动物模型的研究表明，人体最大的器官--皮肤脑啡肽合成增加可能在胆汁淤积性疾病内源性阿片肽升高的过程中起着至关重要的作用。正常人体皮肤的角质形成细胞即可表达甲硫氨酸脑啡肽，且其表达可以通过化学或物理刺激上调。但至今还没有临床研究报告胆汁淤积患者皮肤脑啡肽的表达模式。先前的研究还表明，凝血酶，即在急性和慢性肝损伤过程中所产生的多功能的丝氨酸蛋白酶，可通过激活蛋白酶激活受体-1（protease-activated receptors-1，PAR-1）特异性地增加皮肤角质形成细胞前脑啡肽mRNA的表达。事实上，阻塞性黄疸病程中凝血酶的生成增加，而在解除胆道梗阻后其合成也相应下降。在胆管结扎（bile duct-ligated, BDL）模型中，PAR-1拮抗剂可以防止肝纤维化的发生，这些证据都提示PAR-1受体在胆汁淤积性肝病病程中可能被激活，由此我们假设，在胆汁淤积性肝脏疾病中合成增加的凝血酶，可能通过激活PAR-1的下游信号通路，从而增加外周内源性脑啡肽的合成。在本研究中，我们首先观察了阻塞性黄疸和非黄疸手术患者皮肤脑啡肽的表达情况。其次使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立BDL模型，测定PAR-1受体拮抗剂SCH79797对BDL大鼠痛阈值及血浆和皮肤脑啡肽表达水平的影响。再次，使用人角质形成细胞系（HaCaT），观察凝血酶和PAR-1受体特异性激动剂TFLLR-NH2对HaCaT细胞脑啡肽表达的影响，明确细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulatedprotein kinases1/2，ERK1/2)和P38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）通路可能作用的细胞机制。实验结果如下：1.阻塞性黄疸患者皮肤角质形成细胞脑啡肽表达水平升高黄疸组患者与对照组患者的皮肤组织免疫组化分析显示，与对照组相比，黄疸组患者皮肤表皮棘细胞层和基底层角质形成细胞中甲硫氨酸基脑啡肽的表达水平升高。2. PAR-1受体拮抗剂降低BDL大鼠基础痛阈值、血浆和皮肤角质形成细胞的脑啡肽表达水平按双重结扎胆总管的方法建立大鼠BDL模型，BDL大鼠建模后6至8天，基础热痛阈值与机械性痛阈值均较术前基线值升高。在BDL大鼠建模后4至7天，连续梯度剂量皮下注射PAR-1受体拮抗剂SCH79797(0，0.3，1μg·kg-1·day-1)，观察发现PAR-1受体拮抗剂SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可显著降低BDL大鼠建模后第8天的基础热痛阈值与机械性痛阈值，而相同剂量PAR-1受体拮抗剂对假手术组的基础热痛阈值与机械性痛阈值均无影响。BDL大鼠模型建立8天后，Western blot和PCR检测结果表明，与假手术对照组比较，皮肤组织脑啡肽原mRNA和蛋白表达在BDL组显著升高。PAR-1受体拮抗剂SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可显著降低BDL组大鼠皮肤组织脑啡肽原的表达。大鼠后肢掌侧皮肤免疫组织化学分析的结果表明，甲硫氨酸脑啡肽强烈表达于BDL大鼠皮肤表皮棘层至基底层的角质形成细胞，而PAR-1拮抗剂处理（1μg·kg-1·day-1，4d）可显著减少BDL组大鼠皮肤角质形成细胞中甲硫氨酸-脑啡肽的表达。放射免疫方法测定大鼠建模后第8天血浆甲硫氨酸脑啡肽浓度，BDL组大鼠较假手术组大鼠显著升高。PAR-1受体拮抗剂处理组（1μg·kg-1·day-1，4d）血浆甲硫氨酸脑啡肽浓度较BDL组显著降低，而PAR-1受体拮抗剂亚剂量组（0.3μg·kg-1·day-1，4d）血浆甲硫氨酸脑啡肽浓度与假手术组比较，差异无统计学意义。3.凝血酶通过作用于PAR-1受体诱导角质形成细胞脑啡肽的表达10%DMEM常规培养HaCaT细胞，凝血酶以0.1，1和5U/ml的浓度分别孵育6和24h。RT-PCR检测观察凝血酶孵育对角质形成细胞脑啡肽原、阿黑皮素原和强啡肽原mRNA表达的影响，结果表明凝血酶对脑啡肽原mRNA的表达呈剂量和时间依赖性增加，5U/ml凝血酶浓度孵育24h，可增加HaCaT细胞脑啡肽原mRNA表达约4.5倍。凝血酶在5U/ml的浓度孵育HaCaT细胞6或24小时对阿黑皮素原和强啡肽原mRNA的表达无影响。由于凝血酶还可以激活PAR-3和PAR-4受体，因此我们使用TFLLR-NH2，PAR-1的特异性激动肽来证明凝血酶作用于PAR-1受体的特异性。TFLLR-NH2（100μM）孵育6小时能够诱导HaCaT细胞脑啡肽原蛋白表达的量增加约3倍，而PAR-1受体拮抗剂SCH79797（5μM）与凝血酶（5U/ml）或TFLLR-NH2（100μM）共同孵育可消除后两者对HaCaT细胞脑啡肽原蛋白表达的诱导作用。4. PAR-1受体激活通过ERK1/2和p38MAPK通路诱导角质形成细胞脑啡肽的表达凝血酶(5U/mL)和PAR-1受体特异性激动剂TFLLR-NH2(100μM)孵育6小时可诱导HaCaT细胞ERK1/2和p38的磷酸化，且这一磷酸化作用可以被PAR-1受体拮抗剂SCH79797(5μM)所阻断。为验证ERK1/2和p38磷酸化是否参与了PAR-1激活诱导脑啡肽表达的过程，HaCaT细胞预先分别孵育ERK1/2和p38磷酸化抑制剂U0126（10μM）和SB203580（20μM）后，给以相同剂量凝血酶和PAR-1受体特异性激动剂TFLLR-NH2刺激。Westhern blot实验显示U0126和SB203580减弱了凝血酶和PAR-1受体激动剂诱导的脑啡肽原表达，表明PAR-1受体激活通过ERK1/2和p38MAPK通路磷酸化从而诱导角质形成细胞脑啡肽的合成。综上所述，本研究的结果表明皮肤角质形成细胞中脑啡肽的表达在阻塞性黄疸患者及胆道梗阻模型中均升高，这一结果可能与阻塞性黄疸病人基础痛阈值升高相关。我们的实验数据还表明，阻塞性黄疸病程中升高的凝血酶可通过作用于PAR-1受体而诱导角质形成细胞内源性脑啡肽合成的增加，这可能是胆汁淤积性肝脏疾病中外周组织内源性阿片肽水平升高的机制之一。同时，我们的实验结果提示，PAR-1受体激动剂是一个潜在的镇痛药物，而PAR-1受体拮抗剂可以被用来治疗胆汁淤积患者内源性阿片肽升高相关的并发症。