高产海藻糖菌株的诱变育种、培养基优化及提取纯化的研究

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海藻糖是一种非还原性双糖,其独特的保护功能能使生物大分子(如蛋白质、核酸等)在外界高温、脱水等恶劣环境下免受伤害,近几年成为中外科学家研究的热点。 本文以安琪活性干酵母复壮后的鲜酵母为出发菌株,在确定测定方法和摇瓶培养观察的前提下,分别对其进行紫外、化学和微波诱变。在紫外诱变过程中,对出发菌株共进行了三轮紫外诱变,照射时间是40秒~60秒,每轮照射后,从15株菌中筛选正突变高的菌株进行下一轮的诱变。在进行的第三轮诱变时筛选到一株高产菌株,其海藻糖的产量为19.52g/100g干酵母。化学诱变联合使用了两种低毒性诱变剂,两种诱变剂的最佳配比是:5—溴尿嘧啶300μ mol/L和盐酸平阳霉素5μ mol/L,诱变菌株中最高海藻糖产量为15.98g/100g干酵母。经微波诱变后获得的高产菌株海藻糖的产量为17.01g/100g干酵母。 本文在诱变的同时对酵母菌的操作条件和培养基也进行了优化,在找到海藻糖发酵体系操作最佳条件即最适摇床转速为240r/min、最适温度为35℃的前提下,对培养基中的碳源浓度、氮源浓度、氮碳比、无机盐和微量元素的组成和含量也进行了探讨,从而找出最优培养基配方。 对从活性干酵母中提取海藻糖的工艺进行了研究。作者用蒸馏水从活性干酵母中提取海藻糖的最佳条件是:温度80℃、料液比1:20(干酵母的质量和提取剂的体积比,g/ml),提取1个小时,海藻糖的产量是16.32g海藻糖/100g干酵母,pH值对提取率没有影响。并比较了不同提取剂对海藻糖提取的影响,其中用1%的氧化钙溶液提取,产量可达21.54g海藻糖/100g干酵母。 在研究从啤酒废酵母中提取海藻糖的工艺时,对啤酒废酵母进行了特殊的处理,即把废酵母在烘箱中烘干一定时间后,用粉碎机制成废酵母粉。并比较了传统提取方法(用冷凝回流装置提取)和索式提取法的产量。实验表明,用索式提取海藻糖的产量约是传统提取产量的3倍,提取工艺为:料液比3:50(废酵母粉的质量和提取剂的体积比,g/ml),恒温水浴温度为80℃,真空度0.09Mpa下,提取一小时,产量为6.505g海藻糖/kg干废酵母,而所测啤酒废酵母中海藻糖的总含量是7.98g海藻糖/kg干废酵母。 研究了提取液的纯化、精制及结晶工艺。用碱金属除蛋白、活性炭脱色、离子交换树脂除杂离子和进一步脱色。离子交换树脂采用001×7型阳离子交换树脂和201×7型阴离子交换树脂组成的混合床,阴阳离子交换树脂的体积比为2:1。精制后的提取液浓缩到质量百分数为15%左右,用4倍体积的无水乙醇结晶一周,可得柱状晶体,结晶得率为80%。
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