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目的:1.对快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)检测体系进行本土化改进,以适应国内实验室条件和检测需求;2.对改进后的RFFIT体系进行效果评估;3.将本室已经应用成熟的RFFIT体系与狂犬病疫苗抗原检测方法进行融合,形成改良抗体结合试验(modified antibody binding test, M-ABT)。方法:1.将BSR(BHK-21小克隆)、BHK-21(金黄地鼠肾细胞)、MNA(小鼠成神经纤维瘤细胞)三种细胞以及CVS-11、CTN-181两株狂犬病病毒分别引入RFFIT检测体系,以不同组合方式检测10份标本,初步鉴定检测结果的一致性;继而检测10~6份人血清样品,系统比较不同组合方式下RFFIT检测结果的差异。2.对1011份人血清样品进行RFFIT检测,评估经过本土化改进的RFFIT检测体系的检测效能。3.利用自行制备的Alexa 488标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体对200份标本进行RFFIT检测,评估自主制备的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体进行RFFIT检测的效果。4.将RFFIT与抗体结合试验(antibody binding test, ABT)方案融合,在疫苗样品稀释、剩余中和抗体检测、结果计算方面进行改进,形成改良抗体结合试验(M-ABT)。应用M-ABT对10种灭活狂犬病疫苗在不同库存时间的疫苗效力进行检测,观察疫苗效力随时间改变的情况。结果:1.细胞培养:BSR、BHK-21、MNA细胞生长状况良好,建立了这3种细胞的细胞种子库;2.病毒培养:狂犬病病毒CVS-11和CTN-181株对BSR、BHK-21、MNA细胞适应良好,各代次病毒滴度均高于10~6 FFU/ml,符合RFFIT检测体系对毒种的要求;3.改变细胞系和毒种后RFFIT检测体系的检测效能评估:10份小批量样本检测:分别引进BHK-21和MNA细胞系以及CTN-181病毒株后,RFFIT检测结果与采用BSR和CVS-11组合进行检测所得结果间差别无统计学意义,P值均大于0.05;106份大批量样本的检测结果也表明引入新的细胞系和毒株后RFFIT检测体系与国际标准体系检测结果间差别无统计学意义,并且有很好的相关关系,相关系数(r)大于0.75。4.改进RFFIT检测体系应用效果评估:⑴不同细胞系对RFFIT检测结果的影响:以CVS-11病毒株作为攻击病毒,分别应用BSR、BHK-21、MNA细胞系,对1011份人血清样品进行RFFIT检测,不同检测体系的阳性检出率差别无统计学意义,P值均大于0.05;不同检测体系下阳性标本检测结果几何均值(geometric mean titer, GMT)差别无统计学意义,P值均大于0.05;不同检测体系下检测结果相关性较好,相关系数r大于0.75;⑵不同操作环境对RFFIT检测结果的影响:在不同地理位置、操作环境迥异的实验室,由相同的操作人员应用CVS-11毒株和BHK-21细胞系对上述阳性人血清标本再次进行RFFIT检测,检测结果与原实验室环境下进行检测所得结果间差别无统计学意义,P值均大于0.05。5.采用自主制备Alexa 488标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体后RFFIT检测体系检测效能评估:对200份血清样品的检测显示采用自主制备Alexa 488标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体与进口单抗Millipore DFA 5100检测结果差别无统计学意义,相关系数r =0.980。6. M-ABT法的建立和初步应用效果分析:10种待测狂犬病疫苗经M-ABT法检测,结果显示疫苗中抗原含量与NIH法测定结果差别没有统计学意义,并且具有很好的相关关系,相关系数r=0.927,提示M-ABT法可用于监测狂犬病疫苗抗原的效价变化情况。结论:1.实现了应用不同细胞系和狂犬病病毒株进行RFFIT检测:将致病性更弱的CTN-181毒株应用于狂犬病病毒中和抗体的实验室检测,增加了检测安全性;使用常见的BHK-21、MNA细胞系使更多实验室建立和应用该检测技术成为可能;2.不同操作环境对RFFIT检测结果的影响不明显,因此,同一批操作人员使用相同的检测体系在不同实验室进行RFFIT检测的结果均衡可比并可信;3.自主制备的Alexa488标记抗狂犬病核蛋白单克隆抗体可以用于国内RFFIT检测;4. M-ABT法已经建立,用于灭活狂犬病疫苗效力检测时与NIH法检测结果高度一致,是一种合适的灭活狂犬病疫苗效力监测技术手段。