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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的格拉泽氏病(Gl?sser’s disease)成为当前猪场最重要的细菌性传染病之一,给世界养猪业带来巨大的经济损失。HPS感染最显著的特点是引起猪非常严重的全身性炎症反应,包括多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎等。目前对HPS感染引起炎症反应的分子机制尚不清楚,鉴于此,本课题以炎症或细胞生长分化相关信号通路为研究突破口,解析了HPS感染细胞激活TLR/NF-κB、TLR/MAPK和Wnt/β-catenin信号转导通路的分子机制,探讨感染后生物学效应和细胞间黏附连接机制,为进一步研究HPS感染机制和致病机理提供依据。具体内容如下:1.HPS感染PK-15细胞激活TLR/NF-κB信号通路(1)HPS感染PK-15细胞激活NF-κB信号通路Real-time RT-PCR检测结果显示HPS感染导致受NF-κB调控的炎症因子IL-8、CCL4和CCL5显著上调表达,且NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞后显著下调IL-8和CCL4的表达;Western blot证实HPS感染后IκBα降解和p65磷酸化,且激光共聚焦显微镜观察到NF-κB核转位;荧光素酶报告系统检测HPS感染PK-15细胞后呈时间和剂量依赖激活NF-κB。(2)TLRs和接头分子在HPS感染PK-15细胞激活NF-κB中作用转染TLRs和接头分子的干扰分子后NF-κB激活受到抑制,Western blot检测HPS感染后TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TRAF6蛋白表达水平随感染时间增加而上升,表明HPS感染PK-15细胞通过TLR信号途径激活NF-κB。2.HPS感染PK-15细胞激活TLR/MAPK信号通路(1)HPS感染PK-15细胞激活p38和JNK MAPK信号通路Real-time RT-PCR检测发现SB202190(p38抑制剂)和SP600125(JNK抑制剂)显著下调HPS诱导的IL-8和CCL4表达,Western blot证实HPS感染后p-p38和p-JNK表达量上升,但p-ERK表达量不变,说明HPS感染激活p38和JNK MAPK信号通路,但不激活ERK。(2)HPS感染PK-15细胞激活p38和JNK MAPK信号通路需要TLR参与通过干扰分子实验发现转染psitlr1、psitlr2、psitlr4和psitlr6后p-p38和p-jnk明显下调,而p-erk在整个实验中没有变化。综合以上结果表明hps感染pk-15细胞通过tlr1、tlr2、tlr4和tlr6激活p38和jnkmapk信号通路导致炎症因子产生,而erk信号通路不参与其中。3.hps感染pk-15细胞激活rantes转录调控机制(1)hps感染pk-15细胞激活rantes需要nf-κb信号通路参与通过启动子突变实验发现,rantes启动子结合位点nf-κb、cre和isre位点在hps诱导rantes转录中发挥重要作用,其中nf-κb作用最显著。加入iκbα负调控突变体或抑制剂bay11-7082都能显著下调hps诱导的rantes的转录,说明hps感染激活rantes通过nf-κb信号通路。(2)hps感染pk-15细胞激活rantes需要mapk信号通路参与通过抑制剂实验发现hps感染后sp600125(jnk抑制剂)处理细胞显著下调hps诱导的rantes表达,而sb202190和u0126并没有此作用。转入jnk突变体能显著下调rantes表达,而erk突变体却不能。说明hps感染激活rantes通过jnkmapk信号通路。(3)hps感染pk-15细胞激活rantes需要tlr信号通路参与转入tlrs和接头分子的干扰分子及负调控突变体能明显下调rantes的表达。综合以上结果表明hps感染通过tlr1/tlr2/tlr4/tlr6-myd88/trif-nf-κb和jnkmapk信号通路激活rantes。4.hps感染pk-15细胞和nptr细胞激活wnt/β-catenin信号通路(1)hps感染pk-15和nptr细胞激活wnt/β-catenin信号通路双荧光素酶报告系统证实hps感染pk-15和nptr细胞能激活wnt/β-catenin,westernblot验证hps感染后p-β-catenin降低和p-gsk3β增加,且激光共聚焦显微镜也观察到了hps感染后β-catenin发生核转位,β-catenin参与调控的wnt通路下游靶基因mmp7、cox2和pai-1在hps感染后明显上调,这些靶基因在不同程度导致细胞移动性增强和黏附性减弱。(2)hps感染pk-15和nptr细胞对黏附连接的作用细胞黏附连接主要由β-catenin和e-cadherin组成,前期研究已证实hps感染后β-catenin由细胞膜向细胞质和细胞核转移,现通过westernblot和激光共聚焦技术检测到HPS感染后细胞膜上E-cadherin明显减少,且通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术检测到HPS感染后β-catenin和E-cadherin之间的相互作用明显减弱,说明细胞之间的黏附连接作用减弱,直接导致细胞之间的黏附作用遭到破坏,使细菌更易侵入细胞,进而侵入全身各组织器官导致机体全身性炎症反应。总之,本研究首次报道了HPS感染激活炎症相关信号通路,如NF-κB信号通路、TLR信号通路、MAPK信号通路和Wnt/β-catenin信号通路等,解析了趋化因子IL-8、CCL4和RANTES产生的分子机制,并从全新的角度阐述了HPS感染的致病机理和分子细节,为今后开发出更安全有效的新型副猪嗜血杆菌疫苗和药物奠定了理论基础。