大肠杆菌表达系统,虽然它的载体、受体系统已经比较成熟完善,但其表达产物容易形成包涵体,分泌效率低,此外大肠杆菌是一种潜在病原菌,生长过程中不断释放脂多糖热原物质等内毒素,目前已被限制用于表达生产医药和食品。枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)作为表达系统具有无致病性,不产生内毒素,严格生长在有氧条件下,容易将表达蛋白分泌到培养基中。此外芽孢杆菌的发酵技术已经非常成熟,如α-淀粉酶、蛋白酶等商品化的酶都是利用枯草芽孢杆菌生产的。本实验着重构建可调控的枯草芽孢杆菌高效表达载体。从筛选强麦芽糖启动子出发,并成功构建了麦芽糖诱导型表达载体Pglv-pHCMC04,并通过转化方法比较、优化得出最适转化枯草芽孢杆菌的方法：低盐环境饥饿法,即S法,转化效率达到1.2xlO~4CFU/μg DNA;后为了研究所构建的表达载体特性,本实验从大小基因及信号肽方面着手,通过连接红色荧光蛋白、带有地衣芽孢杆菌信号肽的高温淀粉酶基因、去掉信号肽的地衣芽孢杆菌高温淀粉酶基因、带有灰色链霉菌信号肽的淀粉酶基因等一系列报告基因对其特性研究得出：小基因在枯草中表达的可能性及大基因在枯草中表达需要带信号肽,且枯草在分泌胞外蛋白时对不同属的信号肽具有识别作用。然后对连接有地衣芽孢杆菌信号肽的高温淀粉酶基因进行发酵条件优化,从最适麦芽糖添加量、最适诱导温度、最适诱导物添加时间、和最适接种量几方面着手,进行单因素发酵条件优化,得出了最适的发酵条件,即：将过夜培养菌株接种2%至OD600达到0.55时添加1.5%麦芽糖,35℃下诱导,酶活达最高至2.53(U/mL)。最后通过反向PCR技术将麦芽糖启动子内部的代谢物阻遏元件cre序列进行定点CG→AT的突变,并在以上优化的实验基础上再次测定酶活力,得出高速产酶时间提前,且酶活力提高了近五倍,达到12.2(U/mL)。