论文部分内容阅读
细胞粘附分子gp150在盘基网柄菌细胞发育后期起着重要作用,用两种抗体定位gp150在细胞发育重要阶段的分布,研究显示,在细胞发育的不同时段gp150的定位有着明显的区别。在聚集前的细胞流时期,gp150均匀分布在细胞质内,到了细胞丘时期,gp150就移至多细胞聚集体的周边部位。在蛞蝓体时期,gpl50在前柄细胞的表达量明显大于前孢子细胞,提示了gp150对柄细胞的作用。而当细胞发育至成熟的子实体阶段,gp150大量分布在成熟孢子的外壁上,这一分布特点目前尚无报道。高效液相色谱法检测野生型KAx-3细胞和gp150过表达细胞KAx-3(actl5::lagC)的蛋白激酶A活性显示,在细胞发育的早期(10h之前)PKA在野生型细胞中的活性比KAx-3(actl5::lagC)细胞低。但是在细胞发育的后期,也就是野生型细胞中gp150开始快速积累之后,PKA在野生型细臆中的活性比KAx-3(act15::lagC)细胞高。这些结果说明,gp150和PKA之间可能以某种负反馈环的关系共同调节盘基网柄菌的生长发育。DdCAD-1是盘基网柄菌发育过程中最先表达的细胞粘附分子。为了研究DdCAD-1在细胞发育中的作用,将cadA基因的突变株cadA细胞用中性红染料染色后,发育成的蛞蝓体显示cadA-细胞的前柄细胞与前孢子细胞的分化_出现明显的障碍。外源表达纯化的重组蛋白His6-DdCAD-1与cadA-细胞孵育一段时间后,cadA-的分化异常得到改善。另外,cadA-细胞子实体的孢子产率也有所降低,His6-DdCAD-1蛋白也可以拯救此表现型。DdCAD-1表达的细胞与cadA-细胞混合发育所形成的嵌合体结构显示,表达DdCAD-1的细胞占据在拔顶期结构的顶端及尾部,而这些结构都在非孢子区,最终会死亡。说明DdCAD-1对细胞分化及细胞最终命运决定有重要意义。DdCAD-1作为一种介导盘基网柄菌细胞-细胞连接的粘附分子是通过一个未知的锚蛋白连接在膜上发挥作用的。用不同的抗体和探针进行的Far western blot,都检测到与DdCAD-1有相互作用的膜蛋白条带其分子量在64kDa-98kDa之间。为了分离和鉴定该锚蛋白,将外源表达的GST-DdCAD-1融合蛋白与cadA-细胞作用一段时间之后,GST-DdCAD-1被锚蛋白连接在膜上。化学交联剂DSP处理细胞使GST-DdCAD-1与锚蛋白以共价键结合从而形成稳定的蛋白复合体后,提取膜蛋白,再将该复合体用GST抗体或DdCAD-1抗体连接的protein A珠子将其免疫共沉淀下来。后经MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS质谱分析,结果显示该锚蛋白可能与ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)家族有关。DdCAD-1是一个Ca2+依赖的细胞粘附分子,在盘基网柄菌发育的起始阶段就开始表达。为了研究DdCAD-1的多种角色,我们将cadA-细胞在嵌合体中的行为作了分析。结果显示,在细胞向多细胞体聚集的过程中,cadA-细胞主要占据在多细胞聚集体的中心区域而野生型细胞包裹在cadA-细胞的外围,说明突变细胞可能比野生型细胞的迁移速率要快。在细胞迁移分析中,营养期的野生型细胞、cadA细胞和基因拯救型细胞有着相似的移动速率。然而,经过4h的细胞发育,DdCAD-1突变细胞的移动速率是野生型细胞和基因拯救型细胞速率的2倍以上。而且,在cadA细胞中加入外源表达的DdCAD-1重组蛋白减缓了cadA-细胞的迁移速率。CadA细胞贴附在基质上的能力不如野生型细胞及基因拯救型细胞,共聚焦显微镜显示DdCAD-1存在于细胞与基质的表面,说明DdCAD-1可能与基质的粘附有关。Time-lapse显微镜观察显示,突变细胞在细胞流中的移动速率大约是野生型细胞的1.7倍。两种细胞在进入聚集体中心后都持续运动及旋转,野生型细胞最终与突变细胞分开,占据细胞丘的边缘部位,从而发育成柄。这些结果说明DdCAD-1介导的细胞-细胞及细胞-基质之间的相互作用对细胞运动性产生了一定的影响,不同的细胞运动性调节了细胞特殊的模式形成,最终导致了反绿胡须效应。