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目的:建立不同严重程度支气管哮喘的小鼠模型,并在此基础上研究自然杀伤T细胞(Natural killer T cells,NKT)在不同严重程度支气管哮喘小鼠的作用,初步揭示NKT在支气管哮喘发病中的机制,进而为探索支气管哮喘治疗的新方法奠定一定基础。方法:利用不同浓度卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)激发致敏小鼠,建立不同严重程度支气管哮喘小鼠模型,并利用α-半乳糖神经酰(α-galactosylceramide,α-Galcer)激活NKT细胞对不同严重程度支气管哮喘进行干预。将雌性BALB/c小鼠随机分为5组,即生理盐水(Normal saline,NS)组,1%OVA组、1%OVA+α-Galcer组,5%OVA组,5%OVA+α-Galcer组。于0d、14d给予各处理组小鼠腹腔注射OVA溶液致敏,同时NS组注射NS溶液做对照。在第25天雾化激发前1小时,NS组、1%OVA组和5%OVA组中每只小鼠用移液枪鼻腔滴入NS,1%OVA+α-Galcer组和5%OVA+α-Galcer组中每只小鼠用移液枪鼻腔滴入α-Galcer。第25,26,27天雾化吸入OVA进行激发,NS组予NS雾化,1%OVA组和1%OVA+α-Galcer组予1%OVA雾化,5%OVA组和5%OVA+α-Galcer组予5%OVA雾化,雾化期间观察小鼠行为学改变。最后一次雾化24小时后,用Buxco小鼠肺功能仪有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性(Airway hyper reactivity,AHR);然后眼球取血,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清OVA特异性Ig E;并进行肺部灌洗,收集肺泡灌洗液(Bronchial lavage fluid,BALF),利用全自动细胞计数仪器记录肺泡灌洗液中细胞总数。流式细胞术检测BALF中各类细胞(包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞(Eosinophil,EOS))的比例。CBA法检测小鼠BALF中细胞因子γ-干扰素(interferon,IFN-γ),白介素(Interleukin,IL)-4、-5和-13的水平。HE染色支气管肺组织切片观察气道炎症病理变化,根据血管、气道周围以及肺间质炎性表现情况不同进行评分(分值为0-3分)。结果:1.不同严重程度支气管哮喘模型建立:NS组小鼠在雾化15min后出现轻微烦躁;1%OVA组小鼠在雾化8min出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬行为学改变;5%OVA组小鼠雾化5min后出现上述更为明显症状。1%OVA组和5%OVA组小鼠肺组织病理改变、BALF中细胞总数及EOS比例、BALF中IL-4,-5,13水平、血清OVA特异性Ig E水平和气道阻力较NS组明显升高(P<0.05或P<0.01),且5%OVA组较1%OVA组升高更为明显(P<0.05或P<0.01)。2.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的行为学观察:NS组小鼠在雾化15min后出现轻微烦躁及抓耳挠腮的症状;1%OVA组在雾化8min出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬等症状;1%OVA+α-Galcer组雾化10min后出现上述症状,程度减轻;5%OVA组在雾化5min后出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬、点头呼吸、大小便失禁等;5%OVA+α-Galcer组的在雾化8min后出现上述症状,程度减轻。3.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的组织病理学表现:NS组小鼠支气管、血管周围及肺间质炎性细胞无明显浸润;与NS组相比,1%OVA组炎性细胞轻度浸润,见少许EOS,支气管管腔不规则,肺泡腔融合,差异明显(P<0.05);同1%OVA组相比,1%OVA+α-Galcer组有少许炎性细胞浸润,几乎无EOS浸润,有显著性差异(P<0.01);5%OVA组炎性细胞明显浸润,可见大量EOS,支气管管腔不规则且狭窄明显,周围血管充血水肿,肺泡腔融合进一步扩大(P<0.01);同5%OVA组相比,5%OVA+α-Galcer组弥漫炎性细胞浸润,大量的EOS,支气管管腔不规则且狭窄明显,肺泡腔融合,无明显统计学差异。4.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的BALF中细胞总数及EOS的改变:相对于NS组而言,不同浓度的OVA组小鼠BALF中细胞总数均明显升高,同时5%OVA组BALF中细胞总数升高最多。对于不同严重程度的支气管哮喘小鼠,α-Galcer治疗均能有效降低BALF中的细胞总数(P<0.05)。5%OVA组小鼠的BALF中EOS比例较NS组、1%OVA组升高(P<0.01),但1%OVA组与NS组无明显差异(P>0.05),α-Galcer治疗能够降低1%OVA激发组BALF中EOS的比例(P<0.05),但在5%OVA激发组中没有观察到明显效果。5.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠BALF中细胞因子水平检测:与NS组比较,不同浓度OVA激发能不同程度地升高小鼠BALF中IL-4,-5和-13的水平,同时降低BALF中IFN-γ的水平。α-Galcer治疗能明显降低1%OVA激发组模型小鼠BALF中IL-4和IL-5的水平,升高IFN-γ的水平,但对5%OVA组小鼠作用较弱,无显著性差异。6.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠气道反应性检测:当组胺浓度为4mg/ml、8mg/ml时,1%OVA组和5%OVA组小鼠的气道阻力较NS组明显升高(P<0.01),低剂量组胺刺激时,5%OVA组较1%OVA组小鼠的气道反应性明显升高(P<0.05),而在高浓度组胺刺激时,两组间无明显差异(P>0.05);用不同浓度组胺刺激时,α-Galcer治疗均能有效降低各模型组小鼠的气道反应性。结论:1.1%OVA和5%OVA可以诱导建立小鼠不同严重程度支气管哮喘模型。2.NKT细胞对1%OVA激发的较轻严重程度支气管哮喘的小鼠能改善其行为学、抑制气道炎症水平及减轻气道阻力;而对5%OVA激发的严重程度较重的支气管哮喘的小鼠作用较弱。