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低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力,其中涉及到的表观遗传学机制越来越受到重视。在课题组之前的研究中,我们对比了生活在寒冷地区的南极鱼和多种温带硬骨鱼的转录组和基因组,发现活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)代谢相关通路中的基因表达水平在南极鱼中显著上调。进一步研究发现,低温胁迫能够诱导斑马鱼(Danio rerio)ZF4细胞系中ROS的产生,并且ROS水平取决于低温压力的强度和持续时间。此外,前期研究发现,斑马鱼ZF4细胞整个基因组DNA甲基化水平在短期低温胁迫(18℃5 d)下显著上升,而在长期低温胁迫(18℃30 d)下甲基化水平反而下降。然而低温胁迫下,DNA甲基化与活性氧之间的关系尚未研究清楚。本研究利用斑马鱼ZF4细胞系作为研究材料,对其进行短期低温胁迫:18℃3d、18℃5 d、10℃3 d、10℃5 d,以及长期低温胁迫:18℃30 d。与之同时在显微镜下观察细胞生长状态,并计算细胞比生长率。然后用甲基化敏感酶Hpa II及其甲基化不敏感同切点酶Msp I对细胞基因组进行酶切,计算酶切比例,探测DNA甲基化水平的变化。另外,用抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)或者共济失调–毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated,ATM)抑制剂KU-55933预处理细胞,Western blot检测γH2A.X的表达量变化以及酶切检测DNA甲基化水平的变化。结果如下:1)低温胁迫使得细胞的形态发生改变:正常培养温度下(28℃)ZF4细胞呈不规则三角形,细胞核为卵圆形,胞质突起,细胞边缘清晰。在18℃低温处理5 d后,细胞形态无显著变化,但有少量细胞脱落。在18℃低温处理30 d后,可以看见细胞边缘模糊,大部分细胞不再是不规则三角形,细胞核形态不规则。在10℃处理处理3 d后,ZF4细胞形状从不规则三角形收缩为长条状,细胞间空隙变大,部分细胞死亡。而在10℃处理5 d后,细胞大量死亡漂浮在培养基中。通过检测细胞比生长率发现,28℃细胞以及18℃下处理30 d的细胞在接种后4-5 d都能达到最大比生长速率,分别为0.568和0.355。而18℃下短期处理的细胞贴壁后第1 d有部分细胞死亡,比生长速率为负,之后的第2-7 d比生长速率也较低,在0.06左右。2)低温胁迫处理后,与28℃下培养的细胞相比,无论是在18℃还是10℃,短期低温压力都能导致细胞基因组DNA甲基化水平显著上升,而在18℃低温处理30 d后,细胞基因组DNA甲基化水平明显下降(P<0.05)。3)在18℃和10℃处理3d的情况下,用NAC预处理的细胞相比于对照组,其γH2A.X蛋白表达量明显下降,并且18℃3 d和5 d的ZF4细胞预处理NAC后,相对于未加药组其基因组DNA甲基化水平显著下降(P<0.05)。4)随后我们在细胞低温处理前用一种特异的ATM抑制剂KU-55933对细胞进行预处理。实验发现对于18℃处理5 d的细胞,预处理KU-55933的细胞基因组DNA甲基化水平相比于对照组明显下降了。综合以上结果,本实验通过对斑马鱼细胞进行低温胁迫,研究不同温度和时间点下斑马鱼细胞DNA甲基化水平的变化,发现细胞在短期低温胁迫下DNA甲基化水平上升,而细胞长期在低温下培养后DNA甲基化水平下降。我们推测短期低温胁迫下,由于活性氧的产生导致DNA损伤,DNA损伤激活了DNA损伤修复机制,进一步导致了DNA甲基化水平上升,从而可能对ZF4细胞基因组起到稳定作用,这其中所涉及到的ROS通路和ATM信号通路仍有待进一步研究。本实验证明了短期低温胁迫下DNA甲基化水平上升与ROS产生以及DNA损伤修复有关,为后期斑马鱼细胞低温胁迫分子机制的研究奠定基础。