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研究背景
口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，它的高恶性、易转移和复发是其致死的主要原因。肿瘤组织的微血管密度(Microvessel density, MVD)不仅影响肿瘤的生长和转移，还与患者的不良预后密切相关。OSCC通常具有较高的MVD，并且MVD是判断OSCC患者预后的一个重要指标。实体肿瘤组织中高MVD源于其活跃的血管新生(Angiogenesis)，即指从宿主原有血管网以出芽的方式长出新的血管的过程。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是最重要的血管新生诱导因子之一，常作为治疗的靶点。贝伐单抗(Bevacizumab)是一种重组人源化VEGF单克隆抗体，是美国食品药物管理局首个获批准上市的抗血管新生抑制剂，然而贝伐单抗的临床疗效并没有达到预期，耐药性和适用群体不明等限制了其临床广泛应用。对于大多数OSCC患者，贝伐单抗治疗效果不理想。癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中最重要的间质细胞之一，它可以通过分泌VEGF促进血管新生。CAFs是否与OSCC对贝伐单抗耐药尚不十分明确。
近些年来，细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)作为介导细胞间信息交流的重要媒介可以将其携带多种生长因子转运到受体细胞中进而发挥生物学作用。EVs根据其产生方式分为外泌体(40-200 nm)、微囊泡(100-1000 nm)、凋亡小体(1-5μm)和癌小体(1-10μm)。由于分泌到细胞外的EVs我们难以辨认其生物起源，因此本研究中我们根据EVs的大小对其进行命名，将直径小于200nm的EVs称之为小EVs(small EVs, sEVs)。近年来，人们对肿瘤细胞源性EVs在血管新生中的作用进行了深入的研究，然而尚不清楚CAFs源性EVs在血管新生中的作用。
研究目的
本研究目的为明确OSCC源性CAFs在血管新生中的作用，尤其是CAFsEVs在血管新生中的作用及其生物学机制。揭示在促进血管新生过程中sEVs结合型VEGF与可溶性VEGF的区别，探索逆转sEVs结合型VEGF对贝伐单抗耐药的有效方法。
材料方法
收集51例OSCC组织以及20例的正常口腔上皮组织，通过免疫组织化学方法检测了平滑肌激动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein, FAP)和CD34在肿瘤中的表达情况。Pearson相关系数分析α-SMA和FAP分别与MVD是否相关。从四例手术切取的新鲜OSCC组织中提取CAFs，分别命名为CAF-S1/S2/S3/S4；从正常牙龈组织提取的细胞命名为正常成纤维细胞(Normal fibroblasts, NF)，并进行纯化和培养。细胞免疫荧光染色检测原代细胞表达CAFs典型生物学标志物情况。收集CAFs的条件培养液(Condition medium, CM)，通过划痕实验、肿瘤细胞侵袭微流控芯片模型平台以及CCK8实验等考察CAF-S1/S2/S3/S4自身的迁移和侵袭能力，以及CAFs-S1/S2/S3/S4CM对肿瘤细胞UM-SCC6的迁移、侵袭和增殖能力。通过以划痕实验、Transwell小室细胞侵袭实验、CCK8实验及小管形成实验考察CAFs-S1/S2/S3/S4CM对血管内皮细胞HUVECs的迁移、侵袭、增殖和小管形成能力。
提取CAF-S1/S2/S3/S4和NF分泌的sEVs。蛋白免疫印迹实验(Western blot, WB)、透射电镜以及纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle tracking analysis, NTA)方法鉴定CAFsEVs。超高速离心法去除CM中sEVs，并收集sEV-delCM。小管形成实验考察sEV-delCM、CM以及不同浓度CAFsEVs诱导小管形成的能力。细胞划痕实验以及Transwell小室细胞侵袭实验考察CAF-S1/S2/S3/S4sEVs对HUVECs迁移和侵袭的作用。基质胶栓塞实验考察体内条件下CAF-S1/S2/S3/S4sEVs促血管新生能力。血管新生相关蛋白芯片筛选CAFsEVs和sEV-delCM中的差异蛋白，并通过WB对差异蛋白进行验证。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与HUVECs共孵育24h，通过二代测序分析检测HUVECs中差异表达的基因，并进行GO分析。通过FunRich3.1.3生物学软件对获得的差异蛋白和差异基因进行联合KEGGpathway分析。siRNA干扰技术敲低CAFs中VEGF的表达，WB检测CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中VEGF的表达情况，小管形成实验检测敲低VEGF后，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs促小管形成能力。
ELISA检测等量的完整和裂解的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中CD63、HSP70和VEGF的量。免疫胶体金实验检测VEGF在CAF-S1/S2/S3/S4sEVs的位置。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs未经过或经过heparinaseⅢ处理后，免疫共沉淀和ELISA等方法检测CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与贝伐单抗的结合效率。小管形成实验以及基质胶栓塞实验考察CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过贝伐单抗或贝伐单抗+heparinase预处理后其对血管新生的作用。HeparinaseⅠ和heparinaseⅢ消化处理CAF-S1/S2/S3/S4sEVs后，WB检测sEVs中VEGF的表达情况，ELISA方法检测上清液中VEGF的含量变化。此外，通过ELISA方法检测CAFS1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseⅢ处理后，是否提高CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与贝伐单抗的结合效率。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseI或heparinaseIII消化处理后，用再提取分离出来的CAFsEVs刺激HUVECs，检测HUVECs中的VEGFR2磷酸化情况。
研究结果
1.OSCC组织中的CAFs与高MVD成正相关，且原代CAFs具有很强的促血管新生能力
OSCC组织的间质中α-SMA和FAP高表达；且存在着大量的新生血管。Pearson相关系数分析表明MVD分别与α-SMA和FAP呈正相关。成功提取和获得纯化的原代CAFs，并表达CAFs典型生物学标志物；相比较于NF，CAFs具有更强的迁移和侵袭能力；CAF-CM具有更强的促进UM-SCC6细胞迁移、侵袭和增殖能力。此外，CAF-CM具有更强的促HUVECs迁移、侵袭、增殖和小管形成的能力。
2.CAFsEVs在血管新生中的发挥主要作用
首先对提取的CAFsEVs进行鉴定。WB结果表明CAF-S1/S2/S3/S4sEVs表达CD9、CD63、CD81和HSP70；CAF-S1/S2/S3/S4sEVs呈典型的脂质双分子层结构，圆形或者茶杯状；NTA结果表明提取的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs粒径范围在50-200nm之间，最高峰均出现在120nm左右，颗粒总数为~108particles/mL。当将CM中的sEVs去除后，CM诱导小管形成的能力降低。不同浓度的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs在促血管新生的能力上存在剂量依赖性。相比较于NF-sEVs，CAFsEVs具有更强的促小管形成的能力。此外，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs还可以促进ECs的迁移和侵袭。基质胶栓塞实验结果显示体内条件下CAF-S1/S2/S3/S4sEVs具有很强的促血管新生作用。以上结果提示CAFsEVs可能在诱导血管新生中发挥主要作用。为了深入研究CAFsEVs促进血管新生的机制，我们通过血管新生蛋白芯片筛选出24个差异表达的蛋白，其中包含VEGF、IGF-1、TGF-β等蛋白在CAFsEVs中高表达。为了探究CAFsEVs对HUVEC的影响，我们将CAF-S1/S2/S3/S4sEVs预处理HUVECs后进行RNA测序分析，一共获得1276个差异表达的基因。GO分析发现富集的差异基因参与的生物学过程很多与血管新生相关。通过对富集的差异蛋白和差异基因进行联合KEGGpathway分析，发现VEGFR2/AKT/ERK1/2通路是CAFsEVs促进血管新生的主要信号通路。相比较于rVEGF触发的瞬时信号级联反应，CAFsEVs可以持续激活VEGFR2/AKT/ERK1/2信号通路。为了探究VEGF是否为CAFsEVs的关键因子，我们采用RNA干扰技术下调CAFs中VEGF的表达后，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中VEGF表达亦下降，且其促小管形成的能力降低。这提示VEGF可能是CAFsEVs促血管新生的关键因子。
3.VEGF与CAFsEVs表面的硫酸肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycans, HSPG)相互作用导致CAFs对贝伐单抗耐药
为了揭示VEGF在CAFsEVs中的位置，ELISA检测了等量的完整和裂解的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中CD63、HSP70和VEGF的量。结果显示CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中，CD63和VEGF的量在完整的和裂解的sEVs中几乎是相同的，而HSP70的量在裂解sEVs中明显高于完整的sEVs。此外，CD63和VEGF的免疫胶体金实验的结果显示它们都位于CAF-S1/S2/S3/S4sEVs的表面。为了揭示CAFsEVs结合VEGF是否能被贝伐单抗识别，免疫共沉淀方法检测了CAFsEVs中的VEGF与贝伐单抗的结合效率。结果显示CAF-S1/S2/S3/S4sEVs结合的VEGF对贝伐单抗表现出弱亲和力。为了进一步证实这一发现，我们将贝伐单抗与rVEGF或CAFsEVs孵育，然后用ELISA方法对未结合的贝伐单抗的水平进行量化分析。实验结果显示：随着rVEGF浓度的增加，未结合贝伐珠单抗的量明显下降；但随着CAF-S1/S2/S3/S4sEVs浓度的增加，未结合贝伐单抗的量并没有下降。值得注意的是，在heparinaseIII处理CAF-S1/S2/S3/S4sEVs后，与贝伐单抗结合的VEGF数量明显增加。体外和体内实验结果显示贝伐单抗不能有效抑制CAF-S1/S2/S3/S4sEVs所诱导的血管新生作用。但当贝伐单抗联合肝素酶后，显著提高了CAF-S1/S2/S3/S4sEVs对贝伐单抗的敏感性。以上结果表明肝素酶恢复了CAFsEVs对贝伐单抗的敏感性。VEGF可与细胞表面或细胞外基质上的HSPG上的硫酸肝素链(Heparan sulfate, HS)结合，当CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseI或heparinaseIII处理后，可以释放其中的VEGF，并且提高了CAFsEVs与贝伐单抗的结合效率。此外，经过肝素酶消化处理的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs再刺激HUVECs时，仍可以检测到HUVECs中的VEGFR2磷酸化。然而，经过处理后再提取分离CAF-S1/S2/S3/S4sEVs并没有使VEGFR2磷酸化。这提示VEGF与CAFsEVs表面的HSPG的HS链结合；肝素酶可以将CAFsEVs中VEGF释放出来而不损害其生物活性。
结论
1.OSCC源性CAFs具有显著的促血管新生作用，而且与可溶性因子比较，CAFsEVs在促血管新生中占主导作用。
2.CAFsEVs携带的VEGF是诱导血管新生的关键因子，可以持续激活VEGFR2/AKT/ERK1/2信号通路。
3.VEGF与CAFsEVs膜表面的HSPG结合可能是导致贝伐单抗耐药的重要原因，肝素酶联合贝伐单抗在体内外均可有效抑制CAFsEVs诱导的血管新生。
口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，它的高恶性、易转移和复发是其致死的主要原因。肿瘤组织的微血管密度(Microvessel density, MVD)不仅影响肿瘤的生长和转移，还与患者的不良预后密切相关。OSCC通常具有较高的MVD，并且MVD是判断OSCC患者预后的一个重要指标。实体肿瘤组织中高MVD源于其活跃的血管新生(Angiogenesis)，即指从宿主原有血管网以出芽的方式长出新的血管的过程。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是最重要的血管新生诱导因子之一，常作为治疗的靶点。贝伐单抗(Bevacizumab)是一种重组人源化VEGF单克隆抗体，是美国食品药物管理局首个获批准上市的抗血管新生抑制剂，然而贝伐单抗的临床疗效并没有达到预期，耐药性和适用群体不明等限制了其临床广泛应用。对于大多数OSCC患者，贝伐单抗治疗效果不理想。癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中最重要的间质细胞之一，它可以通过分泌VEGF促进血管新生。CAFs是否与OSCC对贝伐单抗耐药尚不十分明确。
近些年来，细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)作为介导细胞间信息交流的重要媒介可以将其携带多种生长因子转运到受体细胞中进而发挥生物学作用。EVs根据其产生方式分为外泌体(40-200 nm)、微囊泡(100-1000 nm)、凋亡小体(1-5μm)和癌小体(1-10μm)。由于分泌到细胞外的EVs我们难以辨认其生物起源，因此本研究中我们根据EVs的大小对其进行命名，将直径小于200nm的EVs称之为小EVs(small EVs, sEVs)。近年来，人们对肿瘤细胞源性EVs在血管新生中的作用进行了深入的研究，然而尚不清楚CAFs源性EVs在血管新生中的作用。
研究目的
本研究目的为明确OSCC源性CAFs在血管新生中的作用，尤其是CAFsEVs在血管新生中的作用及其生物学机制。揭示在促进血管新生过程中sEVs结合型VEGF与可溶性VEGF的区别，探索逆转sEVs结合型VEGF对贝伐单抗耐药的有效方法。
材料方法
收集51例OSCC组织以及20例的正常口腔上皮组织，通过免疫组织化学方法检测了平滑肌激动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein, FAP)和CD34在肿瘤中的表达情况。Pearson相关系数分析α-SMA和FAP分别与MVD是否相关。从四例手术切取的新鲜OSCC组织中提取CAFs，分别命名为CAF-S1/S2/S3/S4；从正常牙龈组织提取的细胞命名为正常成纤维细胞(Normal fibroblasts, NF)，并进行纯化和培养。细胞免疫荧光染色检测原代细胞表达CAFs典型生物学标志物情况。收集CAFs的条件培养液(Condition medium, CM)，通过划痕实验、肿瘤细胞侵袭微流控芯片模型平台以及CCK8实验等考察CAF-S1/S2/S3/S4自身的迁移和侵袭能力，以及CAFs-S1/S2/S3/S4CM对肿瘤细胞UM-SCC6的迁移、侵袭和增殖能力。通过以划痕实验、Transwell小室细胞侵袭实验、CCK8实验及小管形成实验考察CAFs-S1/S2/S3/S4CM对血管内皮细胞HUVECs的迁移、侵袭、增殖和小管形成能力。
提取CAF-S1/S2/S3/S4和NF分泌的sEVs。蛋白免疫印迹实验(Western blot, WB)、透射电镜以及纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle tracking analysis, NTA)方法鉴定CAFsEVs。超高速离心法去除CM中sEVs，并收集sEV-delCM。小管形成实验考察sEV-delCM、CM以及不同浓度CAFsEVs诱导小管形成的能力。细胞划痕实验以及Transwell小室细胞侵袭实验考察CAF-S1/S2/S3/S4sEVs对HUVECs迁移和侵袭的作用。基质胶栓塞实验考察体内条件下CAF-S1/S2/S3/S4sEVs促血管新生能力。血管新生相关蛋白芯片筛选CAFsEVs和sEV-delCM中的差异蛋白，并通过WB对差异蛋白进行验证。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与HUVECs共孵育24h，通过二代测序分析检测HUVECs中差异表达的基因，并进行GO分析。通过FunRich3.1.3生物学软件对获得的差异蛋白和差异基因进行联合KEGGpathway分析。siRNA干扰技术敲低CAFs中VEGF的表达，WB检测CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中VEGF的表达情况，小管形成实验检测敲低VEGF后，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs促小管形成能力。
ELISA检测等量的完整和裂解的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中CD63、HSP70和VEGF的量。免疫胶体金实验检测VEGF在CAF-S1/S2/S3/S4sEVs的位置。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs未经过或经过heparinaseⅢ处理后，免疫共沉淀和ELISA等方法检测CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与贝伐单抗的结合效率。小管形成实验以及基质胶栓塞实验考察CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过贝伐单抗或贝伐单抗+heparinase预处理后其对血管新生的作用。HeparinaseⅠ和heparinaseⅢ消化处理CAF-S1/S2/S3/S4sEVs后，WB检测sEVs中VEGF的表达情况，ELISA方法检测上清液中VEGF的含量变化。此外，通过ELISA方法检测CAFS1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseⅢ处理后，是否提高CAF-S1/S2/S3/S4sEVs与贝伐单抗的结合效率。CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseI或heparinaseIII消化处理后，用再提取分离出来的CAFsEVs刺激HUVECs，检测HUVECs中的VEGFR2磷酸化情况。
研究结果
1.OSCC组织中的CAFs与高MVD成正相关，且原代CAFs具有很强的促血管新生能力
OSCC组织的间质中α-SMA和FAP高表达；且存在着大量的新生血管。Pearson相关系数分析表明MVD分别与α-SMA和FAP呈正相关。成功提取和获得纯化的原代CAFs，并表达CAFs典型生物学标志物；相比较于NF，CAFs具有更强的迁移和侵袭能力；CAF-CM具有更强的促进UM-SCC6细胞迁移、侵袭和增殖能力。此外，CAF-CM具有更强的促HUVECs迁移、侵袭、增殖和小管形成的能力。
2.CAFsEVs在血管新生中的发挥主要作用
首先对提取的CAFsEVs进行鉴定。WB结果表明CAF-S1/S2/S3/S4sEVs表达CD9、CD63、CD81和HSP70；CAF-S1/S2/S3/S4sEVs呈典型的脂质双分子层结构，圆形或者茶杯状；NTA结果表明提取的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs粒径范围在50-200nm之间，最高峰均出现在120nm左右，颗粒总数为~108particles/mL。当将CM中的sEVs去除后，CM诱导小管形成的能力降低。不同浓度的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs在促血管新生的能力上存在剂量依赖性。相比较于NF-sEVs，CAFsEVs具有更强的促小管形成的能力。此外，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs还可以促进ECs的迁移和侵袭。基质胶栓塞实验结果显示体内条件下CAF-S1/S2/S3/S4sEVs具有很强的促血管新生作用。以上结果提示CAFsEVs可能在诱导血管新生中发挥主要作用。为了深入研究CAFsEVs促进血管新生的机制，我们通过血管新生蛋白芯片筛选出24个差异表达的蛋白，其中包含VEGF、IGF-1、TGF-β等蛋白在CAFsEVs中高表达。为了探究CAFsEVs对HUVEC的影响，我们将CAF-S1/S2/S3/S4sEVs预处理HUVECs后进行RNA测序分析，一共获得1276个差异表达的基因。GO分析发现富集的差异基因参与的生物学过程很多与血管新生相关。通过对富集的差异蛋白和差异基因进行联合KEGGpathway分析，发现VEGFR2/AKT/ERK1/2通路是CAFsEVs促进血管新生的主要信号通路。相比较于rVEGF触发的瞬时信号级联反应，CAFsEVs可以持续激活VEGFR2/AKT/ERK1/2信号通路。为了探究VEGF是否为CAFsEVs的关键因子，我们采用RNA干扰技术下调CAFs中VEGF的表达后，CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中VEGF表达亦下降，且其促小管形成的能力降低。这提示VEGF可能是CAFsEVs促血管新生的关键因子。
3.VEGF与CAFsEVs表面的硫酸肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycans, HSPG)相互作用导致CAFs对贝伐单抗耐药
为了揭示VEGF在CAFsEVs中的位置，ELISA检测了等量的完整和裂解的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中CD63、HSP70和VEGF的量。结果显示CAF-S1/S2/S3/S4sEVs中，CD63和VEGF的量在完整的和裂解的sEVs中几乎是相同的，而HSP70的量在裂解sEVs中明显高于完整的sEVs。此外，CD63和VEGF的免疫胶体金实验的结果显示它们都位于CAF-S1/S2/S3/S4sEVs的表面。为了揭示CAFsEVs结合VEGF是否能被贝伐单抗识别，免疫共沉淀方法检测了CAFsEVs中的VEGF与贝伐单抗的结合效率。结果显示CAF-S1/S2/S3/S4sEVs结合的VEGF对贝伐单抗表现出弱亲和力。为了进一步证实这一发现，我们将贝伐单抗与rVEGF或CAFsEVs孵育，然后用ELISA方法对未结合的贝伐单抗的水平进行量化分析。实验结果显示：随着rVEGF浓度的增加，未结合贝伐珠单抗的量明显下降；但随着CAF-S1/S2/S3/S4sEVs浓度的增加，未结合贝伐单抗的量并没有下降。值得注意的是，在heparinaseIII处理CAF-S1/S2/S3/S4sEVs后，与贝伐单抗结合的VEGF数量明显增加。体外和体内实验结果显示贝伐单抗不能有效抑制CAF-S1/S2/S3/S4sEVs所诱导的血管新生作用。但当贝伐单抗联合肝素酶后，显著提高了CAF-S1/S2/S3/S4sEVs对贝伐单抗的敏感性。以上结果表明肝素酶恢复了CAFsEVs对贝伐单抗的敏感性。VEGF可与细胞表面或细胞外基质上的HSPG上的硫酸肝素链(Heparan sulfate, HS)结合，当CAF-S1/S2/S3/S4sEVs经过heparinaseI或heparinaseIII处理后，可以释放其中的VEGF，并且提高了CAFsEVs与贝伐单抗的结合效率。此外，经过肝素酶消化处理的CAF-S1/S2/S3/S4sEVs再刺激HUVECs时，仍可以检测到HUVECs中的VEGFR2磷酸化。然而，经过处理后再提取分离CAF-S1/S2/S3/S4sEVs并没有使VEGFR2磷酸化。这提示VEGF与CAFsEVs表面的HSPG的HS链结合；肝素酶可以将CAFsEVs中VEGF释放出来而不损害其生物活性。
结论
1.OSCC源性CAFs具有显著的促血管新生作用，而且与可溶性因子比较，CAFsEVs在促血管新生中占主导作用。
2.CAFsEVs携带的VEGF是诱导血管新生的关键因子，可以持续激活VEGFR2/AKT/ERK1/2信号通路。
3.VEGF与CAFsEVs膜表面的HSPG结合可能是导致贝伐单抗耐药的重要原因，肝素酶联合贝伐单抗在体内外均可有效抑制CAFsEVs诱导的血管新生。