研究背景和目的:伴随着新药的不断问世和临床联合用药的增加,药物性肝病的发生率居高不下,约占所有药物损害病例的10%～15%,仅次于皮肤粘膜损害和药物热。国外报告在暴发性肝衰竭患者中,有20%～50%与药物有关。在美国醋氨酚中毒排在药物性中毒的首位。药物性肝病可表现为肝细胞坏死、胆汁淤积、慢性肝炎或肝硬化等,严重者出现暴发性肝衰竭,肝细胞突然大量坏死,发生肝昏迷渐至死亡。当前药物性肝病的治疗主要是祛除病因治疗,即停用肝损害药物,并施以“保肝”治疗药物(多为中药提取物、中成药或还原型谷胱甘肽制剂)。但是,临床实践中很多情况下例如抗结核、肿瘤化疗、器官移植后的免疫抑制等药物,即使出现肝损害也是不能停用的。然而当前大量“保肝”治疗药物并不具备预防性应用肝脏保护作用。此种情况下,就须考虑寻找能够预防药物性肝损害的方法。首先聚焦医用三氧,医用三氧具有其特殊生物药理学特点,近年己应用于肝病治疗及免疫调节治疗。医用三氧应用于疾病治疗已有近50年历史。随着对三氧的作用机制研究积累,现已部分明确了三氧具有某些特殊的生物学与药理学特性:(1)增加红细胞代谢,改善微循环;(2)作为强氧化物可诱导激活组织细胞产生抗氧化酶,增强组织细胞清除自由基的能力;(3)低浓度三氧具有免疫激活和调节活性。中药治疗,在药物性肝病的治疗中占有非常重要的地位。临床和实验研究表明中医药治疗药物性肝病有肯定的疗效,尤其在健脾护肝、利胆退黄、活血化瘀等方面有独特的疗效。而且合理地选择运用中药,不良反应小。目前对于医用三氧的基础研究主要集中在生物学与药理学特性方面,然而预防性治疗作用报道较少,仅国外有在器官缺血再灌注前应用三氧可以减轻器官损伤的报道。本研究首次应用医用三氧及中药对酉昔氨酚犬急性中毒性肝病的预防性治疗作用进行初步探索,并将二者疗效进行平行对比,为进一步的临床应用提供实验依据。方法:1.实验药物受试药物是医用三氧及中药护肝方,医用三氧由三氧发生器(德国哈斯乐OZONOSAN alpha Plus 1107)制备,是纯氧与三氧的混合气体,本研究用三氧浓度为20mg/L。中药护肝方组成:黄芪30g,党参20g,白术20g,生地黄15g,熟地黄15g,丹参15g,白花蛇舌草10g,板蓝根10g。2.模型制作将醋氨酚溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成600g/L的浓度,新鲜配制使用。用配制好的醋氨酚溶液采用多点皮下注射:首次剂量为750mg/kg体质量,首次注射后9h和24h分别进行第2次和第3次注射,用量均为200mg/kg体质量。3.分组和给药健康杂种犬24只,随机分为4组,分别是正常对照组,模型对照组,中药预处理组和医用三氧预处理组,每组6只。中药预处理组予护肝方直肠灌药,每只犬按4.14g/kg剂量,1次/日,三氧预处理组予医用三氧直肠灌注,每次150ml,1次/日,共15天。然后除正常对照组外,其余三组犬同时进行醋氨酚皮下注射造模。4.观察及检测指标观察犬的精神,饮食,行动,大小便等。于醋氨酚造模前及造模后24,48,72,96 h,7,14 d抽血检测肝功能指标(ALT、AST、TBIL)、血氨(AMMO)、凝血酶原时间(PT)、尿素氮(BUN)、肝组织病理检查。实验犬在实验前以及醋氨酚注射后死亡时或存活14d时取肝脏组织做病理观察。5.统计方法用SPSS软件(13.0版处理),各数据以均数±标准差((?)±s)表示,因为实验属重复测量设计,故首先对数据进行重复测量方差分析,然后对各组分别进行组内重复测量的方差分析,时间因素间有显著性差异时进行LSD多重比较。对各个测试时间点的组间数掘,采用One-WayANOVA进行方差分析,有显著性差异时进行多重比较。P＜0.05为有显著性差异。ANOVA进行方差分析时首先考察方差齐性。结果:1.犬的一般状态各组犬醋氨酚造模前精神良好,呼吸平稳,饮食及二便正常,对外界刺激反应灵敏。造模后,各组犬均表现为不同程度的精神困倦,巩膜黄染,摄食量减少,呕吐,小便黄,日渐消瘦;有些犬出现烦躁,醉酒样步态;有些犬精神萎靡,嗜睡,对外界刺激反应迟钝,伤口难以止血。以上表现在首剂醋氨酚注射后48h～72h最为明显,且模型对照组最为严重。生存期比较:醋氨酚模型对照组两只犬在造模后48 h出现呼吸困难,昏睡,渐至昏迷,最终分别在造模后56,75 h左右死亡,本组其余犬及中药预处理组与三氧预处理组犬造模后14d仍存活。2.肝脏形态学观察2.1肝脏形态学变化2.1.1肉眼观正常犬肝脏呈红褐色、质软而脆。模型对照组注药造模后肝脏体积缩小,肝表面有块状瘀斑,肝脏包膜皱缩,有腹水,肠系膜静脉和胃底静脉曲张。中药预处理组及三氧预处理组的肝脏体积缩小不明显,瘀斑少,包膜完好。2.1.2组织病理学检查正常犬肝小叶结构完整,肝细胞呈索状排列,形态正常。注药造模后14天,模型对照组肝索紊乱,汇管区胆管增生,肝细胞呈弥漫性浊肿,片状坏死、嗜酸性变、肝内淤胆,部分区域肝窦扩张,充血,汇管区炎性细胞浸润。与模型对照组相比,中药预处理组和三氧预处理组的肝组织病理变化程度轻、病灶范围小,肝细胞气球样变和脂肪变性明显。3.生化指标分析造模前各个指标组间无显著性差异(P均＞0.05),表明开始时的分组是均衡的。不同时间及不同组间均有显著性差异(P=0.000),重复因素7个不同水平(7个时间点)间差异有显著性意义,即各组各项指标均随时间变化,时间与组别存在交互效应(P=0.000),从各项指标随时间变化的趋势看,各组的区别具有统计学意义。造模前后不同时间有显著性差异,三氧组、中药组与模型对照组均如此。模型对照组ALT,AST,TBIL,PT指标在注射醋氨酚造模后24 h即升高,72 h时达高峰;AMMO在造模后48 h达高峰;BUN在造模后24 h达高峰。与模型对照组比较:三氧组和中药组ALT明显低于模型对照组(三氧组在造模后24,48,72,96 h,7,14 d;中药组造模后24,72,96 h,7 d),有显著性差异(P＜0.05或0.01);同样三氧组和中药组AST,TBIL,AMMO升高也较模型对照组低,有显著性意义(P＜0.05或0.01)。三氧组和中药组PT值在造模后48,72,96h比模型对照组低,有显著性差异;三氧组BUN造模后24h显示出明显低于模型对照组,有显著性差异。三氧组与中药组相比,造模后7,14dALT明显低于中药组,有显著性差异;三氧组造模后7 d时AST也显著较低;造模后96 h,7 d,三氧组TBIL显著较低;三氧组PT明显短于中药组(造模后48 h,72 h);三氧组AMMO明显较低(造模后24 h,48 h):三氧组BUN明显低有显著性意义(造模后24h)。结论:中药护肝方与医用三氧的直肠灌注应用能够有效预防醋氨酚所致犬急性中毒性肝损害,抑制血氨升高和PT的延长,且医用三氧效果优于护肝方。医用三氧作用机制可能与调节免疫,改善组织器官微循环,激活肝脏的自由基等毒性代谢产物清除系统,提高肝脏的抗氧化能力有关,中药则具有益气解毒,凉血活血之功效。本实验为三氧与中药的临床预防应用提供了实验依据。医用三氧及中药护肝方有可能成为预防药物性肝病的新方法。二者临床疗效有待在临床试验研究中证实。