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猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列入A类传染病。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,为单股正链RNA病毒。猪瘟病毒囊膜蛋白E2具有良好的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体,能对强毒株的攻击提供免疫保护。囊膜蛋白E0(Erns)也能诱导机体产生中和抗体且有一定的免疫保护作用。本研究调查了江西省部分地区猪瘟病毒E2基因的分子流行情况,同时对9株猪瘟病毒进行了全基因组测序,并构建了表达猪瘟病毒E2和E0蛋白的重组猪痘病毒,为猪瘟的防控打下基础。1.江西省猪瘟病毒E2基因的分子流行病学调查本试验收集了26个2014年和2015年江西省猪瘟阳性样品,采用RT-PCR方法扩增E2基因并测序,通过与标准的参考毒株比对,以E2基因序列进行同源性分析及系统进化分析,结果表明,收集的26个样品都属于2.1基因型,且22个为2.1b基因亚型,4个为2.1d基因亚型。2.猪瘟病毒全基因组测序及序列分析本试验采用PK15细胞从病料中分离猪瘟病毒,并设计了八对覆盖基因组全长的套式PCR引物,扩增出了9株猪瘟病毒毒株的全基因组,每个毒株测序两次或以上。用全基因组序列、5’UTR、4个结构蛋白、8个非结构蛋白以及3’UTR的序列构建系统进化树,以E2基因构建的系统进化树为参考,结果表明,以全基因序列和全长的Npro、NS4B和NS3基因序列可以作为基因分型的依据,以全长的E0、E1、NS2、NS5A、NS5B基因序列可能是一种新的分型方法,而以全长的5’UTR、C、3’UTR、P7和NS4A序列不能对毒株基因型进行准确分型。对本实验分离的9株病毒进行株基因分型,结果表明,7株为2.1d基因亚型,2株为2.1b基因亚型。3.构建表达增强红色荧光蛋白的重组猪痘病毒本试验构建表达增强红色荧光蛋白(ERFP)的重组猪痘病毒,先扩增出SPV017-020基因的左臂和右臂,再扩增出带有猪痘病毒晚期启动子P11的ERFP基因片段,通过融合PCR方式将三片段融合成大片段,通过酶切和连接的方式,将其克隆至pUC19质粒中,并通过转染预先感染痘病毒的PK15细胞来观察ERFP表达情况。结果表明,酶切结果和测序结果与预期一致,同时转染结果表明ERFP能在重组猪痘病毒内有效地表达,说明本试验成功构建了此猪痘病毒转移载体,命名为pSW-ER11。本试验为之后使用ERFP为筛选标记来纯化重组猪痘病毒打下基础。4.构建表达猪瘟病毒E2和E0蛋白的重组猪痘病毒本试验构建表达猪瘟病毒E2和E0蛋白的猪痘病毒转移载体,先从猪瘟病毒基因组中克隆E2和E0基因片段,基因的表达受痘病毒晚期启动子P28调控,通过In-Fusion Clone步骤将目的片段克隆至线性化的pSW-ER11载体中。结果表明,酶切结果和测序结果与预期一致,成功构建了各猪痘病毒转移载体。构建的质粒通过转染产生的表达猪瘟病毒E2和E0蛋白的重组猪痘病毒,为研究重组猪痘病毒表达的猪瘟病毒E2和E0蛋白的免疫保护功能提供基础。5.pcDNA3.1+质粒的改造本实验对pcDNA3.1+质粒进行改造,通过双酶切将含有T7 RNA聚合酶启动子的CMV启动子片段切除,而后将不带有T7 RNA聚合酶启动子CMV启动子片段克隆至载体中,以删除载体的T7 RNA聚合酶启动子,防止把载体的序列转录到猪瘟病毒RNA。结果表明,pcDNA3.1+已被成功删除了T7 RNA聚合酶启动子。为构建猪瘟病毒的感染性克隆打下基础。