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晚期糖基化终末产物（AGE）是蛋白质、核酸或脂质等大分子物质的氨基在无酶参与条件下,自发地与葡萄糖或其它还原糖的醛基或酮基反应所生成的稳定的共价化合物。在糖尿病病人AGE生成加剧,并与其受体相互作用介导糖尿病多种并发症的发生发展,同时,AGE在衰老、正常血糖时也会有升高,这主要由氧化应激和炎症引起。AGE的致病作用主要依赖于其特异性受体—晚期糖基化终末产物受体（RAGE）。RAGE是细胞表面的一种多配体受体,是免疫球蛋白超家族成员之一,RAGE虽因结合AGE得名,但研究表明它可以结合多种配体如钙粒蛋白（calgranulins/S100）,高迁移率族蛋白B-1（HMGB-1）,淀粉样蛋白（Amyloid）等。RAGE与不同配体结合,参与不同疾病的发生发展,引起一系列细胞功能异常如:参与糖尿病慢性并发症、炎症反应、肿瘤的侵袭和转移、透析相关性淀粉样变（DRA）以及阿尔茨海默氏病（AD）的发生发展,同时也有报道指出RAGE与神经再生过程有关。RAGE和配体结合后,并不介导与其结合配体的清除或降解,而是通过细胞内的信号转导途径激活下游的细胞外信号激活反应性氧自由基（ROS）、小GTP酶Ras、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核转录因子-κB（NF-κB）等信号分子引起一系列的病理反应。实验证明,用抗体阻断RAGE和AGE结合,可以抑制细胞内的ERK1/2的激活。但是RAGE受到刺激后首先和哪种蛋白结合,如何将细胞外信号传导至上述信号分子,目前尚无明确报道。RAGE胞内段由41个富含负电荷的氨基酸组成,该段很可能在配体结合受体后,将信号传递给下游分子,产生细胞效应,因此研究RAGE胞内段的功能对阐明RAGE下游的信号通路具有重要意义。因为蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见也是最重要的一种共价修饰方式,是基因表达和蛋白合成的重要调控者,几乎参与生命活动的全部过程,细胞内大部分重要的生命过程都涉及蛋白磷酸化,而且蛋白磷酸化也是多种信号转导途径中极其重要的环节。那么AGE对下游信号分子的激活是否依赖于RAGE磷酸化修饰状态的改变?这个问题对阐明RAGE胞内的下游信号转导有重要意义。因此鉴定RAGE的磷酸化位点可以为进一步认识RAGE的下游细胞信号转导通路奠定坚实基础。在本研究中,我们根据蛋白质磷酸化位点在真核生物中常见于丝氨酸残基、苏氨酸残基和酪氨酸残基及蛋白质功能磷酸化位点在进化上具有保守性这两条原则,利用生物信息学（bioinformatics）的分析方法和网上的生物信息学资源,对进化中不同种属的RAGE胞内段的氨基酸序列进行比对,从而预测得到RAGE可能的磷酸化位点是:第391、399、400位的丝氨酸（S391、S399、S400）和第401位的苏氨酸（T401）。我们构建了上述4个位点发生突变的表达载体:pcDNA3-HA-RAGE（A391）、pcDNA3-HA-RAGE（A399）、pcDNA3-HA-RAGE（A400）、pcDNA3-HA-RAGE（A401）,即将S391、S399、S400、T401突变为丙氨酸（A）。为了避免内源性RAGE对细胞转染RAGE突变体后的功能研究有影响,我们的研究需要在一种不表达RAGE的细胞株HEK 293内进行。首先我们需要确定RAGE在受到AGE刺激后是否发生了磷酸化状态的改变。因此我们将pcDNA3-HA-RAGE（WT）转染HEK 293细胞,给予不同时间的AGE刺激,利用抗HA抗体偶联的微珠进行免疫沉淀,并用丝氨酸磷酸化检测试剂盒检测RAGE的磷酸化程度是否随刺激时间的延长而发生改变。结果表明,在细胞生理状态下RAGE是受到丝氨酸磷酸化修饰的,受到AGE刺激以后,RAGE的丝氨酸磷酸化程度较静息状态下减弱。其次我们需要进一步鉴定RAGE的磷酸化位点,我们转染pcDNA3-HA-RAGE（A391）、pcDNA3-HA-RAGE（A399）、pcDNA3-HA-RAGE（A400）、pcDNA3-HA-RAGE（A401）四个突变体,利用抗HA抗体偶联的微珠进行免疫沉淀,并用丝氨酸磷酸化检测试剂盒和苏氨酸磷酸化检测试剂盒检测RAGE的磷酸化程度,以转染pcDNA3-HA-RAGE（WT）为对照。结果可见,RAGE（A400）的丝氨酸磷酸化程度明显减弱,其他组无明显改变,这就证明了RAGE第400位的丝氨酸S400是RAGE胞内段的一个磷酸化位点。前期研究表明在单核巨噬细胞和肿瘤细胞中,RAGE可以激活ERK1/2,而且经多条信号通路都最终激活下游区的NF-κB,从而引起多种细胞因子（IL-1、IL-8、MCP-1、TNF、VEGF）的释放。所以我们通过检测分别转染RAGE不同突变体的HEK 293细胞,在受到AGE刺激时对ERK1/2MAPK磷酸化状态的影响,来进一步确定RAGE的功能性磷酸化位点。因此我们在HEK 293细胞中转染pcDNA3-HA-RAGE（WT）,给于不同时间的AGE刺激,利用Western blot检测ERK1/2磷酸化状态。结果显示,在HEK 293细胞中,转染pcDNA3-HA-RAGE（WT）后,AGE刺激可以激活ERK1/2磷酸化,且以5 min最强。然后我们将这四个突变表达载体转染入HEK 293细胞中,并给予AGE刺激5 min,检测ERK1/2磷酸化状态的变化。以转染pcDNA3-HA-RAGE（WT）为对照。结果发现,作为阳性对照,RAGE（WT）受到AGE刺激5 min后,可以促进ERK1/2磷酸化,RAGE（A391）、RAGE（A399）禾NRAGE（A401）在受到AGE刺激后,也可以促进ERK1/2的磷酸化,而RAGE（A400）却不能促进ERK1/2的磷酸化。这就证明了RAGE第400位的丝氨酸S400在将AGE信号传递给下游信号分子的过程中有着重要的作用,如果将其突变将会影响在AGE刺激下ERK1/2的磷酸化。这更进一步证实了RAGE S400确实是RAGE胞内段的一个功能性磷酸化位点。通过上述研究可以得出以下结论:1.RAGE在生理状态下存在丝氨酸磷酸化,AGE刺激可以诱导RAGE去磷酸化。2.HEK 293细胞转染RAGE后,AGE刺激可以诱导RAGE（WT）下游的ERK1/2磷酸化。3.AGE诱导的ERK1/2的激活依赖于RAGE（S400）磷酸化状态的改变。4.S400是RAGE的一个功能性磷酸化位点。