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烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草致病型(Phytophthora Parasitica var.nicotianae Tucker)引起的病害,是烟草生产上最具毁灭性的病害之一,中国1950年首次报道该病发生在黄淮地区,至今该病在包括台湾省在内的华南,华中、华东和西北烟区均普遍发生,并多与烟草青枯病混合发生,故危害更为严重。其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区。烟草根黑腐病是有寄生串珠霉(Thielaviopsis basicola(Brek.etBr.)Ferr.)引起的烟草根部主要病害之一,在我国云南、贵州、湖北等省发生严重,发病率可达30%以上。近年来河南、山东、安徽等省该病逐年加重已成为影响烟草生产的主要病害之一。对河南烟区这两种主要土传病菌黑胫病菌和根黑腐菌群体遗传结构的准确认识和分子检测技术的建立对实现病害的有效防治具有重要的意义。本研究选取2011年采自河南烟区的32个烟草黑胫病菌菌株,根据4个核基因(包括rDNA-ITS,β-tubulin,Ras和Gpi基因)和1个线粒体基因(Cox1)的保守序列,克隆和测序分析了 160个相应的基因DNA片段,并构建了系统进化树,结果显示,这5个基因DNA序列在病菌群体内碱基序列与参照基因序列相比保守度在83%-100%不等,平均基因型多样性指数(M)为1.4227。基于单基因进化关系显示,就rDNA-ITS序列而言将32个不同的菌系分为6个群,β-tubulin,Raas,Gpi,Cox1分别将其分为3个群,综合使用5个基因联合序列联合构建群体进化系统树,揭示了分布于河南省14个县区的32个分离菌系可分为2个明显的组群,包括了 15个不同的联合基因型,基因型多样性指数为2.35,反应了病菌致病变种内存在的遗传变异多样性。其中,最为优势的2个联合基因型分别涵盖8个菌系(c基因型)和6个菌系(e基因型),为优势基因型。然而,各基因型间总遗传分化水平很低,组群间的遗传距离仅为0.0005,说明河南菌株可能属于同一有效群体。同时,菌株遗传分化(亲缘)关系与地理来源之间也没有显著的相关性,表明烟草黑胫病菌河南群体内存在有效的菌源交流,没形成明显的地理亚群体分化。本研究选取2013年采自河南烟区的5个烟草根黑腐病菌菌株,从美国购进编号为ATCC18723的标准菌株,根据rDNA-ITS,β-tuu1in,TEF-1a三个核基因,克隆和测序分析了 18个相应基因DNA片段,结果显示,这三个基因的DNA序列在菌群内和参照基因序列的相对保守度为999%-100%。使用这3个基因序列构建系统进化树,揭示河南菌系及ATCC18723同处于 一个分枝上,将三个基因联合构建进化树,河南菌系和ATCC18723之间的遗传距离小于0.002,表明烟草根黑腐病菌菌系的遗传分化程度低。根据本研究获得的基因序列建立了烟草黑胫病菌和烟草根黑腐病菌双重分子检测技术体系。研究设计的引物能特异性扩增标靶病原菌,阴性对照菌株镰刀菌,赤星病菌,灰霉病菌,蛙眼病菌,烟草角斑病菌和烟叶组织DNA中均不能扩增出目的产物。灵敏性检测结果显示,两对烟草黑胫病菌检测引物YYI-F/R,YYH-F/R的检测最低限度为100fg和1OpgDNA/样品;两对烟草根黑腐病菌检测引物TBITS1419-F/R,TB β 1419-F/R的检测最低限度为10fg和1pgDNA/样品。研究中建立的荧光定量PCR检测和常规双重PCR检测体系,可以满足田间检测和病害早期预警及早期侵染规律研究的需要。