聚酮合酶（polyketide synthase）是催化产生多种类型的聚酮化合物及其复杂的衍生物的关键酶，其中部分化合物具有重要的药理学活性。分离、鉴定与异源表达这些合成生物活性化合物的新PKS，成为生物技术药物研究领域的重点。本研究提取了中国东海的一株解淀粉芽孢杆菌F201721的基因组DNA，构建了它的细菌人工染色体文库（BAC文库），通过设计简并引物，拼接扩增出PKS基因簇的编码序列共计531835bp。通过数据库和生物信息学软件对基因组进行了解析：它是一个基因簇，编码9个模块，负责编码41个与聚酮合成相关的酶。与陆地来源的解淀粉芽孢杆菌FZB42中PKS相比，海洋来源的PKS在启动子位置附近缺少了25个碱基。通过软件预测推测，这25个碱基可能调控PKS的表达。通过EMSA分析，发现有特异性的蛋白与这25个碱基结合，蛋白分子量约为35KD。结合抑菌实验发现，这个与启动子特异性结合的蛋白表达发生在细菌对数生长期，也就是说，这个蛋白对于PKS的表达是有抑制作用的。在这两株菌中，蛋白在对数生长期与含有25个碱基的启动子序列是有结合的，抑菌圈直径是2cm；在对数生长期后期，FZB42中有蛋白和含有缺失碱基的启动子序列结合，但是在F201721中未发现蛋白可以与之结合，结合抑菌圈实验，在细菌生长稳定期后期，FZB42中的抑菌圈明显比F201721的大，表明这个蛋白可以抑制PKS的表达，在对数期后期，特异性蛋白从启动子序列上A脱落，启动了PKS的表达，使得FZB42中macrolactins的产量大于F201721的macrolactins的产量，表现为FZB42中抑菌圈大于F201721中的抑菌圈。验证了缺失的25个碱基在macrolactins表达方面起调控作用，也说明了这两株菌中，PKS的表达机制是有差异的。一、构建F201721的细菌人工染色体文库这株来自中国东海的芽孢杆菌F201721是本室保存的。通过低熔点琼脂糖法抽取细菌基因组DNA，获得的基因组DNA分子量在200kb，再用BamHⅠ酶切10min，获得平均长度为100kb的片段，电洗脱去盐去离子以后，使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，通过蓝白斑筛选获得含有合适片段大小的阳性克隆，通过BAC末端测序，期望获得含有PKS编码序列的阳性克隆，经blastn分析发现，筛选得到的阳性克隆都不含完整的macrolactins编码序列,不能直接用于异源表达。二、获得的PKS编码序列并对其进行序列和功能分析根据已经全基因组测序的FZB42上PKS编码序列中，通过NCBI的Conserved Domains Database找出保守区域并适合设计引物14对，每对引物上下游间隔为6kb-10kb，退火温度在65℃-73℃之间，上下游引物的退火温度相差不超过5℃，引物长度为25bp,通过使用TaKaRa公司的Lataq酶进行长链PCR扩增，PCR模板为含有PKS编码序列的阳性克隆中的BAC重组子，PCR产物做胶回收以后送Invitrogen（英骏）进行序列测定，通过片段拼接得到了macrolactins生物合成基因簇的编码序列，全长531835bp,经NCBI数据库序列以及功能分析，我们得到了F201721的PKS基因簇编码序列，共有9个模块，含有负责聚酮合成的41个酶，发现这些序列与FZB42中的核苷酸序列高度同源，最低的相似度是97%，最高的达到100%。氨基酸相似度最高为99%，氨基酸最低为96%。在分析序列时，我们注意到，与陆地来源的解淀粉芽孢杆菌相比，海洋来源的解淀粉芽孢杆菌F201721中PKS编码序列前面的启动子区域缺少了25个碱基，通过网上不同类型的promoter predict软件分析发现，缺失的25个碱基在PKS编码序列上游启动子位置，指示在PKS表达调控上起作用。三、验证两株菌中聚酮合酶基因簇由于序列差异引起的表达调控差异使用不同的类型的promoter predict软件分析，预测显示缺失片段位于启动子区域。由于在枯草芽孢杆菌中，次级代谢产物的调控通常是通过转换不同的σ因子来调控的，我们预测该缺失片段可能通过结合特定蛋白调控macrolactins表达。通过蛋白迁移率实验，发现有蛋白在细菌对数生长期到稳定期前可以与这段DNA结合。随着细菌生长进入平台期，FZB42中特异结合该序列的蛋白消失了，而细菌的抑菌圈明显增大，说明与缺失片段结合的蛋白调控了Macrolactins的表达，使得Macrolactins的产量在稳定期后期明显增加。也侧面验证了编码序列确实可以合成大环内酯类24元环的聚酮类化合物Macrolactins。