【摘 要】
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猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）可以导致几种猪病综合征。其中,危害最为严重的是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。PCV2的衣壳蛋白（Capsid,Cap）是它最重要的免疫保护性抗原,它可以引起机体产生针对PCV2的特异性抗体,所以Cap是用于研发基因工程疫苗的一种理想的靶抗原。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称作奥耶斯基氏病（Aujes
【基金项目】
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浙江省重点研发计划项目（2020C02011）；
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猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）可以导致几种猪病综合征。其中,危害最为严重的是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。PCV2的衣壳蛋白（Capsid,Cap）是它最重要的免疫保护性抗原,它可以引起机体产生针对PCV2的特异性抗体,所以Cap是用于研发基因工程疫苗的一种理想的靶抗原。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称作奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）导致的一种急性传染病。猪场一旦感染很难根除。猪圆环病毒2和伪狂犬病毒对我国养猪业造成的危害巨大。相较于普通的将PCV2及PRV病原进行混合而制成的二联疫苗,PCV2/PRV重组疫苗具有更好的安全性及免疫原性。但迄今为止还没有有效的表达猪圆环病毒2 Cap的重组伪狂犬病毒的二联疫苗研制成功,所以构建表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒对于上述疾病防治及技术的升级来讲非常重要。本研究选择以PRV复制非必需蛋白gI（US7）作为插入位点,以TK、gE缺失的HD/c株为亲本,利用CRISPR/Cas9技术结合经典的同源重组技术对重组病毒进行拯救,最终我们得到了 1株TK-/gE-/gI-/Cap+重组伪狂犬病毒。对拯救的重组病毒进行验证,结果显示PCV2b的cap基因已经正确插入到HD/c株基因组中,与亲本株相比,重组毒株和亲本HD/c株的一步生长曲线及蚀斑大小并无明显差异,表明PCV2 cap基因的插入并不影响重组病毒的复制。通过Western Blot及间接免疫荧光试验对Cap蛋白的表达进行验证,结果显示cap基因虽然成功插入到亲本株基因组中,但其并不能成功表达Cap蛋白,且EGFP表达盒的删除并不是影响Cap蛋白表达的原因,查阅文献推测可能的原因为依赖PRV自身的启动子不足以启动外源基因的表达,需要强大的启动子以确保外源基因的稳定表达。为了给重组伪狂犬病毒提供配套的检测工具,本研究制备了抗伪狂犬病毒囊膜gB糖蛋白的单克隆抗体。以伪狂犬病毒HD/c株为模板,扩增gB基因并将其构建到pET-28a原核表达载体上,并利用IPTG诱导表达gB蛋白。再以变性纯化的gB蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合。通过亚克隆筛选出阳性杂交瘤细胞,得到3个能稳定分泌抗gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。对制备的gB单克隆抗体的特性进行鉴定,结果显示制备的gB单克隆抗体能和原核表达、真核表达和病毒感染细胞中的gB蛋白具有良好的Western Blot及间接免疫荧光反应性,且3个单克隆抗体细胞株识别的抗原表位区域位于第63-124 aa区域。
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