论文部分内容阅读
脊髓损伤(SCI)可引起患者严重的神经功能障碍或永久性残疾。治疗脊髓损伤的研究大致可分为两个主要领域:神经保护和神经再生。神经保护疗法侧重于阻止继发性损伤的进一步发展,而神经再生疗法则侧重于通过修复断裂的脊髓神经回路来恢复受损或失去的功能。大量的研究报告显示活性氧(ROS)在脊髓损伤后过量产生,并在继发性损伤的级联反应中发挥关键性作用,清除ROS可以防止或减轻SCI后的继发性损伤。为此,本论文首先设计合成了一系列ROS响应性的高分子材料,并研究其氧化响应性性质及用作活性氧响应性药物载体的潜力。将其中一种活性氧响应性的材料制备成脂质聚合物纳米粒子探索其脊髓损伤后清除ROS的神经保护治疗效果。同时,针对脊髓损伤修复过程中存在的多重再生障碍,设计、制备了一种同时担载神经干细胞、西妥昔单抗和FTY720药物的多功能可注射水凝胶,系统研究了其在脊髓损伤后的神经再生作用。具体研究内容和主要结论如下:(1)设计合成了一种用苯硼酸频哪醇酯连接的ROS响应性PEG化脂质材料mPEG2k-PBPE-DSA。首先通过Passerini反应合成了含有苯硼酸频哪醇酯的末端带有炔基的聚乙二醇单甲醚衍生物mPEG2k-PBPE-alkynyl,然后与叠氮化双硬脂酸甘油酯(N3-DSA)通过Cu(Ⅰ)催化的点击反应,制备成具有H2O2响应性的mPEG2k-PBPE-DSA。在含有 H2O2 的水溶液中,mPEG2k-PBPE-alkynyl 可以被H2O2氧化,并且氧化程度随H2O2的浓度增加而加快。基于原位1HNMR和质谱分析,证明了 mPEG2k-PBPE-DSA的氧化断裂机理。另外,mPEG2k-PBPE-DSA可以在水溶液中自组装成稳定的纳米胶束。该胶束可以被MCF-7细胞内吞,对巨噬细胞RAW264.7有很好的生物相容性。DLS结果显示H2O2条件下mPEG2k-PBPE-DSA纳米粒子的粒径逐渐减小,证明该纳米胶束可以在H2O2存在时被氧化最终解体。此外,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控制释放。上述实验表明,mPEG2k-PBPE-DSA有望用作活性氧响应性纳米药物载体。(2)将1,4二噻烷结构引入聚氨基酸侧链,合成了一种新型ROS响应性聚氨基酸材料。首先,通过缩合反应制备1,4-二噻烷修饰的L-谷氨酸酯(DTG),并合成相应的α-氨基-N-羧基内酸酐单体(DTGNCA);再利用端氨基聚乙二醇单甲醚mPEG5k-NH2引发开环聚合,合成具有1,4-二噻烷侧链的聚谷氨酸嵌段共聚物mPEG-b-PDTG。该两亲性聚合物在水环境中自组装成球状纳米粒子。用DLS,红外和浊度实验研究纳米粒子的H202响应行为。结果显示,在H202水溶液中,1,4-二噻烷的硫醚结构被氧化成亚砜,从而使聚合物由两亲性变成亲水性,导致纳米粒子解体。纳米粒子的氧化速率随H202浓度的增加而加快,而无H2O2存在时,纳米粒子保持稳定。同时,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控释。上述实验表明,含1,4二噻烷侧基的聚氨基酸材料有望用作ROS响应性纳米药物载体。(3)开发了活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子作为活性氧清除剂,以减轻急性脊髓损伤后的继发性损伤。采用简单的硫醇-炔点击聚合法制备了一种高密度硫醚基聚合物,即聚丙二醇(甲硫基)乙酸酯-乙二醇二(β-巯基丙酸酯)[poly(PMT-co-EGDM)],并用卵磷脂(lethicin)和 PEG-DSPE 的混合物进一步包封,形成活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子,称为PELPNPs。体外实验表明该PELPNPs能清除过量产生的ROS,减轻炎症反应,保护胶质细胞和神经元免受H2O2诱导的氧化损伤。动物实验结果表明,PELPNPs通过对神经元和髓鞘的有效保护,减少了损伤面积,明显改善了 SCI大鼠的运动功能的恢复。此外,我们还对PELPNPs的作用机理进行了验证研究,而且其在体内外均表现出良好的生物相容性和生物安全性。因此,我们提出的具有ROS清除功能的脂质聚合物纳米粒子在SCI的抗氧化治疗方面具有较大的潜力。(4)用氧化葡聚糖(o-Dex)和末端肼解的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHNH2),通过醛基和肼形成腙键作为交联点,制备出可注射的共价适应性水凝胶Gel4P-hy-D。该水凝胶快速成胶,模量和脊髓组织相似,且有一定的膨胀性和粘附性,适用于受损脊髓处的填充。我们用Gel4P-hy-D水凝胶搭载神经干细胞(NSCs),同时加入促进NSCs向神经元分化的西妥昔单抗和抑制胶质瘢痕的药物FTY720,制备成具有多功能的可注射水凝胶(G-N-C-F)。体外和体内实验研究结果表明,西妥昔单抗和FTY720对神经再生具有协同作用。将G-N-C-F注射到急性脊髓横断损伤大鼠的损伤部位,验证其对脊髓再生和功能恢复的治疗作用。实验结果证明,植入G-N-C-F的大鼠可以增加脊髓损伤中心的神经元数量,减少胶质瘢痕的产生,促进轴突再生,从而更好的重建受损神经网络,最终有助于脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。对比实验说明多功能的可注射水凝胶的组织修复效果优于单一功能的水凝胶。该多功能的可注射水凝胶为SCI的神经再生治疗提供了新的思路,有望用于SCI的临床研究。