论文部分内容阅读
GST pull-down法作为蛋白质相互作用的体外研究方法之一，简单、方便、易操作，但研究未知的蛋白质相互作用难度较大，少有报道；肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PeptidylArginine Deiminase type IV, PAD4）作为类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis, RA）易感基因，其介导的组蛋白瓜氨酸化是哺乳类固有免疫–中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NET）形成的必要条件。PAD4也可以作为共抑制因子下调抗癌基因P53诱导的下游基因的表达，被认为参与了肿瘤的发生，但具体作用机制尚不清楚；PAD4主要在免疫细胞中表达，是五种肽酰基精氨酸脱亚胺酶中唯一具有核定位信号的蛋白多肽瓜氨酸化酶。实验室通过蛋白免疫印迹发现TNF-α有诱导HL-60细胞中PAD4蛋白核转移现象，PAD4蛋白核转移后分子量变大，推测入核过程中可能与其他蛋白发生相互作用。明确其核转移时相互作用蛋白及阐明其核转运机制，对于认识PAD4在正常生理状态和病变情况下的基因功能具有重要的意义，实验室选取HL-60细胞，利用GST pull-down assay在这方面进行了初步探索。目的：构建GST-PAD4载体及核定位信号缺失载体GST-PAD4-NLS-，通过优化表达条件得到高纯度融合蛋白GST-PAD4及GST-PAD4-NLS-，用GST pull-down assay初步寻找PAD4核转移时与之相互作用的蛋白。方法：用TNF-α处理HL-60细胞，蛋白免疫印迹观察PAD4在HL-60细胞中核转移，然后构建带有GST标签的PAD4以及PAD4核定位信号缺失（PAD4-NLS-）的原核表达载体；通过转化大肠杆菌BL21菌株，获得重组蛋白表达的工程菌，经过优化诱导表达条件，获得重组蛋白的可溶性表达；再利用Sepharose4B亲和层析法分别纯化出重组蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-，将纯化的重组蛋白分别固定在谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Sepharose4B)上，与来源于HL-60细胞中的总蛋白共同孵育，富集可能与GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-发生相互作用的蛋白；最后经SDS-PAGE联合银染初步寻找可能与PAD4或PAD4-NLS-发生相互作用的蛋白。结果：蛋白免疫观印迹察到TNF-α有诱导PAD4在HL-60细胞中核转移现象，PAD4入核后分子量变大，TNF-α诱导2h左右PAD4入核现象明显；优化获得融合蛋白GST-PAD4最佳可溶性表达条件：16°C下菌液OD600约为0.4时加入0.1mM IPTG诱导12h以上，在这一条件下获得高纯度的融合蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-；利用GST pull-down方法捕获到PAD4核转移时可能与之相互作用的蛋白并利用SDS-PAGE联合银染的方法进行了初步分析。结论：观察到TNF-α诱导PAD4核转移后有分子量增加的现象；通过优化表达条件可以获得高纯度的融合蛋白；利用GST pull-down方法初步筛查到一条与PAD4相互作用的可疑蛋白条带。为进一步明确其核转移时相互作用蛋白及阐明其核转运机制提供了基础。