目的:本课题通过无血清有限稀释法,从人结直肠癌细胞株HCT116中筛选获得结直肠癌干细胞样克隆球,采用流式细胞术检测克隆球的肿瘤干细胞标志物CD133、CD44的表达、细胞周期分布和软琼脂集落形成实验,鉴定筛选出的克隆球细胞为结直肠肿瘤干样细胞;通过结直肠肿瘤干样细胞耐药性实验,证明筛选出的结直肠肿瘤干样细胞较HCT116细胞具有更强的耐药性。方法:1.运用有限稀释无血清培养法,从结肠癌细胞株HCT116中筛选肿瘤干细胞样克隆球,并扩大培养建立肿瘤干细胞克隆亚系。2.通过流式细胞术检测肿瘤干细胞标志物CD133、CD44和检测细胞周期分布情况,以及软琼脂集落形成实验,鉴定筛选出的克隆球细胞的肿瘤干细胞特性。3.采用CCK-8法研究氟尿嘧啶和槐耳清膏分别对结肠癌细胞生长增殖的抑制作用,比较药物干预后的人结肠癌干样细胞和HCT116细胞表现出的耐药性差异。结果:1、通过无血清有限稀释法筛选出肿瘤干细胞样克隆球14个,细胞株克隆球形成率为28.6%;该群克隆球细胞表现为:较HCT116细胞具有更高的成球率(43.2%),增殖快,可不断传代,予含血清培养基培养可重新分化,表现出肿瘤干细胞不断增殖、自我更新和再分化的特点。2、流式细胞术肿瘤干细胞标志物检测,HCT116中有87.97%的细胞表达CD133+CD44+,克隆球细胞中93.87%的细胞表达CD133+CD44+。流式细胞术检测细胞周期,克隆球中77.18%的细胞处于G1期,HCT116中49.00%的细胞处于G1期,差异有统计学意义。软琼脂集落形成实验中,克隆球1和2的集落形成率分别为51.97%和39.54%,HCT116细胞的集落形成率为5.67%,差异有统计学意义。3、肿瘤干样细胞耐药性实验中,随着用药浓度的升高,氟尿嘧啶和槐耳清膏对肠癌细胞的生长增殖抑制作用均逐渐增强;相同的药物浓度下,肿瘤干样细胞生长增殖被抑制的程度较原株细胞低。结论:1、从人结直肠癌HCT116细胞株中能筛选出肿瘤干细胞样克隆球。2、与原株相比,筛选出的克隆球细胞肿瘤标志物CD133+CD44+阳性表达率和处于G0期的细胞比例更高,具有更高的集落形成率、更强的耐药性,鉴定为肿瘤干样细胞。