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背景:阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的一种常见类型,其发病率逐年升高,造成较重的社会负担。AD主要病理特征包括由淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外大量沉积形成的老年斑(SP)和神经元丢失。补阳还五汤(BYHWT)是中医补血祛瘀的经典名方,临床用于脑血管意外的治疗有确凿的疗效。本文在前期研究中发现BYHWT对AD小鼠学习记忆能力有明显改善作用,与晚期糖基化终产物受体(RAGE)/低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)信号通路有关。本研究继续对BYHWT作用的机制进行深入研究,以确定BYHWT是否作用于脑微血管内皮细胞(BMEC),影响BMEC外排转运体LRP1内向转运体RAGE调整Aβ中枢代谢而起到防治AD的作用。目的:研究BYHWT对AD小鼠学习记能力、海马形态、内皮细胞和血管形态、细胞凋亡和转运子RAGE/LRP1影响,研究BYHWT对采用Aβ25-35造模的微血管内皮细胞损伤的影响,通过观察AD细胞模型形态学变化、炎症介质分泌、细胞凋亡率和RAGE/LRP1转运体表达,探究药物是否通过影响BMEC功能从而对血脑屏障及神经血管单元产生影响,寻找药物的治疗靶点。方法:BYHWT提取物依据临床给药煎煮法制备。体内实验:选择7月龄APP/早老素(PS1)双转基因小鼠作为AD模型进行实验,采用聚合酶链式反应(PCR)验证APP和PS1基因表达。APP/PS1小鼠随机分为5组(n=20),Model组,多奈哌齐组,BYHWT高、中、低剂量组,另选择C57BL/6小鼠20只作为Control组。Control组和Model组给等体积的生理盐水,阳性药组给多奈哌齐0.001g·kg-1,高、中、低剂量组分别给37.06、18.53、9.26g·kg-1BYHWT(生药量),连续灌胃35日后行Morris水迷宫实验,测定小鼠学习记忆能力,采用苏木精-伊红(HE)染色、透射电子显微镜和Tunel染色观察各组小鼠海马形态结构和细胞凋亡。采用透射电镜(TEM)观察小鼠海马微血管形态改变,采用免疫组织化学(IHC)方法检测海马LRP1、载脂蛋白(Apo J)、RAGE 和 VCAM-1 表达。体外实验:体外培养脑微血管内皮细胞(BMEC),用含有24μmol/L的Aβ25～35细胞培养液培养24h,模拟AD细胞模型,用150μmol/L的BYHWT进行干预。采用光学显微镜观察细胞的一般形态,采用TEM观察细胞的超微结构,ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ25-35分泌,FCM检测细胞凋亡率,WB法检测细胞RAGE、LRP1、ICAM-1、VCAM-1、ApoJ、ApoE、NF-κBp65 蛋白表达。结果:体内实验Morris水迷宫实验显示,在空间探索实验中,与Model组相比,BYHWT高、中剂量组和Donepezil组小鼠穿越平台次数明显较低,目标象限停留时间明显延长。在定位航行实验中,BYHWT高、中剂量组和Donepezil组小鼠的逃避潜伏期明显缩短。HE染色显示Control组小鼠海马CA1区细胞排列规则,模型鼠细胞排列紊乱、细胞层数较少、核仁不清晰,BYHWT组海马CA1区细胞排列比较规则、核仁圆形或椭圆形、细胞层数较多。TEM观察到,ADModel组海马毛细血管变形且窄,内皮细胞不完整,腔外有大空泡,突触融合。经过BYHWT治疗,海马神经元形态逐渐恢复,毛细血管结构清晰,突触形态较好。Tunel法测细胞凋亡显示,与Model组相比,高、中剂量组海马Bcl-2/Bax比值明显增加。IHC显示,与Model组相比,高、中剂量组海马LRP1和ApoJ表达明显升高,且RAGE和NF-κBP65表达明显降低。体外实验通过透射电镜(TEM)观察血管内皮细胞形态,Model组细胞形态学与Control组细胞相比,发生异常改变,如细胞变圆、增殖减慢、细胞核固缩、核周隙增宽、核质比异常、粗面内质网扩张、线粒体空泡变性、微绒毛减少、脱落等。BYHWT低、中、高剂量组及Donepezil组与Model组相比细胞具一定程度的形态学恢复,其中BYHWT以中、高剂量组恢复较明显,且高剂量组及Donepezil组与Control组细胞形态最为接近。ELISA法显示,BYHWT高、中剂量可以下调Aβ诱导的BMEC细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ25-35的含量,从而减轻Aβ诱导的BMEC细胞产生的炎症反应。同时流式细胞术显示BYHWT高、中剂量可以降低由Aβ诱导的BMEC细胞凋亡。Western Blot法显示BYHWT三个浓度组与Model组相比对RAGE蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,高浓度组作用最明显(P<0.01);BYHWT三个浓度组对LRP1蛋白表达有明显促进作用,呈剂量依赖关系,低浓度组即有明显作用(P<0.01);BYHWT三个浓度组对NF-κBP65蛋白表达有明显下调作用(P<0.05);BYHWT三个浓度组中仅高浓度组对ApoE蛋白表达有上调(P<0.05),低浓度和中浓度组没有作用。与Model组相比,BYHWT三个浓度组对ICAM-1、VCAM-1蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,中浓度组(P<0.05)、高浓度组(P<0.01)作用最明显,差异有统计学意义;BYHWT三个浓度组对NF-κBp65蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,中、高浓度组作用最明显(P<0.01)。结论:体内实验表明BYHWT高、中剂量可改善AD小鼠学习记忆能力,恢复AD小鼠海马CA1区形态,改善海马血管内皮细胞形态,其机制与BYHWT增强AD小鼠海马RAGE蛋白表达,减弱AD小鼠海马LRP蛋白表达密切相关。体外实验进一步得出BYHWT通过调节RAGE/LRP1转运体调节Aβ代谢,通过抑制NF-KBP65信号通路影响ICAM-1、VCAM-1蛋白介导的血管内皮炎症,改善Aβ诱导的脑微血管内皮细胞损伤引起的形态学改变,对脑微血管内皮细胞损伤产生保护作用。