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水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的成员,可危害水稻、玉米、小麦、大麦等植物,给农业生产造成了巨大的经济损失。RBSDV主要通过灰飞虱(Laodelphax sreiatellus Fallen)进行传播。RBSDV基因组由10条双链核糖核酸组成,含有13个开放阅读框(open reading frame, ORF),编码13个蛋白。为获取灰飞虱传播RBSDV所需的介体因子,本研究利用酵母双杂交技术,选取RBSDV S10编码的外壳蛋白P10为诱饵,筛选灰飞虱cDNA文库,以期获得与RBSDVP10蛋白特异互作的灰飞虱蛋白。首先,利用RT-PCR方法扩增获取RBSDV外壳蛋白基因P10,并将其构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,之后通过顺序转化法筛选灰飞虱cDNA文库。阳性克隆子cDNA插入片段的大小通过PCR进行鉴定,并转化到大肠杆菌DH5a后进行测序,测序序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析。通过筛选共获得455个阳性克隆,送交公司测序的有377个克隆,经分析分别编码15种不同的互作蛋白,如actin、serpin peptidase inhibitor3、RACK和GAPDH3等。研究结果为进一步获取灰飞虱传播RBSDV的介体因子及揭示介体传毒机制奠定了基础。目前生产上对由RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern Rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)引起的病害缺乏有效的抗病品种。本文利用重组PCR技术融合来自RBSDV S6编码的基因片段S6和SRBSDV S6编码的基因片段SR6获得长为600bp的S6-SR6融合基因片段,RBSDV S10编码的基因片段S1O和SRBSDV S10编码的基因片段SR10通过重组PCR进行融合获得长为600bp的S10-SR10融合基因片段。将所得融合基因片段以反向重复的方式连入pBS-intron载体,之后定向插入到植物表达载体pCABIA1301上,并转化农杆菌,从而构建了同时含有两种病毒基因的RNAi植物表达载体pCABIA1301-S6-SR6(i/r)和pCABIA1301-SR10-S10(i/r)。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计一致。该研究结果为培育具有抗RBSDV和SRBSDV的植物新品系奠定了基础。为分析病毒基因编码的沉默抑制子功能,我们在前期研究的基础上,对RBSDVS9-1编码的P9-1蛋白的抑制子活性进行了进一步分析。农杆菌共浸润的方法表明,P9-1能抑制由正义RNA介导的局部沉默,不能抑制由dsRNA引起的局部沉默,不能抑制由GFP引起的系统沉默,但能阻碍沉默信号的传导。相关研究表明,某些病毒抑制子基因的表达量远高于其他基因组组分。为了明确P9-1基因在基因组中的相对表达丰度,本研究利用Real-Time PCR技术分析了P9-1基因相对其他基因组组分的表达丰度。结果表明,在RBSDV水稻病株和玉米病株体内P9-1基因相对表达量均不是最高的。