研究背景目前全球范围内致盲性眼病的主要病因之一依然是角膜盲,角膜移植是角膜病致盲患者治疗不可逆角膜盲最主要、最有效的复明手段。近年来组织器官移植在临床上取得了巨大的进步,普遍应用于各个器官功能衰竭的治疗。由于眼表组织特有的解剖学、免疫学以及机械屏障的特性,相对其他组织器官缺乏血管以及淋巴管,在没有高危因素的角膜移植病例中,术后两年移植物存活良好的概率高达90%。但是角膜并不是绝对意义上的免疫赦免组织,角膜移植术后难以避免的免疫排斥反应仍然是阻碍手术成功的主要原因之一。在高危角膜移植的病例中术后免疫排斥反应尤为严重,在全身应用或局部应用免疫抑制药物的情况下,由于移植手术受体植床大量新生血管生成和长期的炎症反应,术后免疫排斥造成手术成功率下降明显。所以防治角膜移植术后的免疫排斥反应,提升角膜移植物的术后存活率以及改善预后的研究依然是近年来的热点问题。近年来,临床防治角膜移植术后免疫排斥反应的最主要手段包括皮质类固醇激素和环孢霉素A等药物的局部或全身应用,虽然上述方法在临床研究中取得了一些较为满意的结果。但是这些免疫抑制药物的作用与其临床的用药剂量和用药时间呈明显的正相关,还因为其非特异性抑制患者免疫系统应答的特点,临床应用过程中将严重破坏患者的免疫系统机制,并因为其产生的多种术后并发症反而加剧了免疫排斥反应的发生,导致角膜移植手术的最终失败。树突细胞是机体细胞中能高效摄取、加工处理并递呈抗原的一类细胞,它还可以在诱导未致敏初始T细胞增殖的同时激活T细胞免疫应答促进依赖性抗体产生。树突细胞具有显著的分化异质性,在分化成熟过程中经历的各种前体细胞、未成熟细胞和成熟细胞不仅在细胞表型上差异明显,其在机体免疫应答过程中的作用也各不相同。当前体细胞分化为未成熟树突细胞时,分布于机体外周组织器官间质中,这时的树突细胞具有较强的抗原吞噬能力并处理外源性抗原,并结合到内源性组织相容性复合体分子上。未成熟树突细胞在机体内部环境稳定时处于静息状态,此时的迁移属于非抗原依赖性,而当机体受到外源性刺激时未成熟树突细胞按照抗原依赖性的方式迁移,并且在迁移过程中受部分刺激因素影响而逐渐向成熟树突细胞分化,在这个过程中活化并参与启动机体的免疫应答机制。研究中把既能呈现未成熟树突细胞表型又能够诱导T细胞免疫耐受的树突细胞称为致耐受树突细胞。通过体外诱导骨髓源性树突细胞分化为致耐受树突细胞介导机体免疫耐受,从而治疗角膜移植术后免疫排斥是一种切实可行的实验研究方案。然而获得稳定的致耐受树突细胞是促进免疫耐受并延长移植物存活的关键。目前实验研究中诱导分化获得未成熟树突细胞的方法主要是通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子共培养或雷帕霉素、环孢霉素、糖皮质激素等药物在体内体外抑制树突细胞分化。上述方法在实验研究中取得了一些较为满意的结果,但获得的树突细胞是否具有长期维持未成熟树突细胞的表型和实现致耐受树突细胞功能的特点还有待商榷。NF-κB是机体细胞在凋亡、增殖、分化以及免疫应答过程中的关键调控转录因子。有超过150种的基因通过NF-κB介导参与多种因子的调控表达,其中包括Toll样受体、趋化因子受体、急性期反应蛋白、生长因子、抗凋亡蛋白、细胞因子受体以及细胞粘附分子等。NF-κB对树突细胞的分化成熟具有重要作用。未成熟树突细胞在机体内受到抗原刺激后引起抗原依赖性迁移并且在迁移过程中逐渐向成熟树突细胞分化。而NF-κB可以参与启动MHC、CD80和CD86的基因转录。树突细胞在成熟过程中的MHC、CD80、CD86和细胞间粘附分子和共刺显著高表达,同时刺激未致敏的初始T细胞进行免疫应答。T细胞的刺激活化需要双重或者多重信号的诱导,这些信号就包括上面提到的CD80、CD86、MHC等信号以及相应的抗原多肽。NF-κB蛋白是由Rel和NF-κB两个家族成员共同构成的,一个是前体家族包括NF-κB1和NF-κB2;另一个是Rel家族包括c-Rel、v-Rel、Rel-B和Rel-A (p65)。Rel/NF-κB家族的Rel同源结构域包括末端结构域、DNA结合结构域、二聚体结构域和核定位序列结构域。除了成员间具有相同的同源结构域外,Rel-A, Rel-B和c-Rel分子还具有转录激活结构域,在功能上两个结构域也有所区别,转录激活结构域主要负责NF-κB二聚体的激活与转录。核定位序列结构域可以介导Rel-A进入细胞核内并通过Rel-A、Rel-B和c-Rel所特有的转录激活结构域介导Rel-A的基因转录。Rel-A的磷酸化和乙酰化是影响NF-κB活化并启动转录调控的关键,目前对NF-κB活性调控的研究重点主要集中在对Rel-A的蛋白修饰。当丝氨酸276受到激酶刺激后,改变了非磷酸化状态下Rel-A的分子结构,增强Rel-A与环腺苷酸应答元件结合蛋白的结合,从而提高NF-κB的转录活性。因此我们推测通过干扰Rel-A基因表达,影响Rel-A的磷酸化程度,进而减弱NF-κB的转录活性来获得致耐受树突细胞。RNA干扰技术是通过细胞导入外源性和内源性dsRNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA序列特异性降解,从而引起转录后基因沉默的现象。由于RNA诱导沉默复合物可以二次利用并经过RNA聚合酶的催化,因此在整个过程中可以催化以并放大RNA的效果。siRNA导入技术的发展为RNA干扰技术的应用提供了更多的选择,各种病毒介导的siRNA表达是最为有效的一类载体。慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体,虽然属于逆转录病毒载体的范畴。它有着更广泛的宿主对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,有效对抗转录沉默作用从而达到持久性表达,载体中可以插入特异性的启动子和增强子,提高转入基因的转录靶向性,使慢病毒载体中的目的基因在特定的组织细胞中表达。本课题在前期研究和最新进展的基础上,构建大鼠角膜移植免疫排斥模型,通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL-4共培养诱导分化大鼠骨髓源性树突细胞,采用RNA干扰技术,筛选出高效抑制Rel-A表达的siRNA序列,构建针对Rel-A的siRNA慢病毒载体细胞,将慢病毒载体转染至骨髓源性树突细胞,降低NF-κB表达及活性,以求获得稳定致耐受树突细胞的新方法,同时将该致耐受树突细胞注入大鼠角膜移植模型,探寻Rel-A低表达的致耐受树突细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制,为临床角膜移植诱导免疫耐受治疗免疫排斥反应提供理论和实验依据。第一部分大鼠骨髓源性树突细胞的体外诱导分化及生物学性能检测研究目的结合最新研究进展,进一步探讨体外诱导分化具有未成熟树突细胞表型和致耐受特性的树突细胞的方法。研究方法本部分实验根据不同培养周期诱导大鼠骨髓源性前体细胞分化为未成熟树突细胞。通过显微镜观察不同培养时间中树突细胞的生长及形态特征；通过流式细胞仪检测诱导分化后树突细胞的表面标志物CD80、CD86和MHC-Ⅱ的阳性表达率；通过混合淋巴细胞反应实验验证不同培养时间诱导分化的未成熟树突细胞是否具有致耐受树突细胞的生物学特性；并使用酶联免疫吸附实验鉴定树突细胞培养上清中的IFN-γ表达水平。结果培养至第六天和第八天的树突细胞在CD80、CD86和MHC-Ⅱ的阳性表达率方面明显低于(p<0.05)培养至第十天的树突细胞；培养至第六天和第八天的树突细胞在混合细胞反应中的吸光值明显低于(p<0.05)培养至第十天的树突细胞；树突细胞培养上清中的IFN-γ表达水平在三组间逐渐升高。结论持续培养至第六天时收获的树突细胞具有未成熟树突细胞的表型并且具有致耐受树突细胞的生物学特性。体外诱导大鼠骨髓性树突细胞分化为致耐受树突细胞过程中对培养时间和诱导分化培养液的精确调整极为敏感,树突细胞表面标志物的特异性表达不能作为鉴定致耐受树突细胞的唯一标准。第二部分构建p65低表达慢病毒载体和慢病毒转染对树突细胞生物学性能及细胞因子影响研究目的设计针对p65低表达的siRNA序列,建立慢病毒载体系统并验证其对靶基因的沉默效果,将慢病毒转染至诱导分化后的致耐受树突细胞,进一步探讨针对p65低表达的慢病毒对于树突细胞生物学性能的影响。研究方法根据siRNA设计原则与方法,设计三条针对大鼠p65基因的特异性干扰序列和一条阴性对照序列；体外转染293T细胞后,通过反转录聚合酶链式反应实验和蛋白质免疫印迹实验检测细胞中p65的蛋白表达和mRNA表达水平；通过流式细胞仪检测在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后对树突细胞表型的影响；通过混合淋巴细胞反应实验验证在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后对树突细胞致耐受生物学特性的影响；通过反转录聚合酶链式反应实验和酶联免疫吸附实验检测在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后树突细胞培养上清中IL-10、IL-17和IFN-γ的蛋白表达与mRNA表达水平；通过染色质免疫共沉淀实验和荧光素酶报告基因实验验证p65对IL-10、IL-17和IFN-γ的直接影响作用。结果设计合成针对p65低表达的siRNA序列可以有效抑制细胞中p65和NF-κB的蛋白表达水平并显著降低p65的mRNA表达水平(p<0.05)；蛋白质免疫印记实验结果中对照组的p65和NF-κB条带明显强于慢病毒组；混合淋巴细胞反应实验中脂多糖刺激组(LPS)相比其他三组对大鼠同种异体T细胞的增殖具有明显刺激作用(p<0.05)；流式细胞术的分析结果中脂多糖刺激组(LPS)在CD80、CD86和CD11c+MHC-Ⅱ的检测中均明显高于(p<0.05)对照组(Control)、慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS);细胞上清的p65、IL-17和IFN-γ蛋白表达和mRNA检测结果中脂多糖刺激组(LPS)明显高于(p<0.005)其他三组；细胞上清的IL-10蛋白表达蛋白表达和mRNA检测结果中对照组(Control)明显高于(p<0.005)脂多糖刺激组(LPS)、慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS),脂多糖刺激组(LPS)明显高于(p<0.005)慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS);荧光素酶报告基因实验结果中IFN-γ、IL-17和IL-10的慢病毒组RLU指数都明显低于对照组；染色质免疫共沉淀实验结果中慢病毒组的IFN-γ、IL-17和IL-10条带相对input组和慢病毒空白对照组都明显减弱。结论建立的针对p65低表达的慢病毒载体可以有效减少p65和NF-κB的蛋白表达水平并显著降低p65的mRNA表达水平。无论是否进行脂多糖刺激,慢病毒转染后的骨髓源性树突细胞都可以保持未成熟树突细胞的表型和致耐受树突细胞的生物学特征。慢病毒转染后的骨髓源性树突细胞可以减少IL-17和IFN-γ的蛋白表达和mRNA表达水平。p65可以直接结合到IL-10、IL-17和IFN-y的启动子区域上,并启动IL-10、IL-17和IFN-γ的转录翻译表达,且引物序列具有特异性。第三部分p65低表达的致耐受树突细胞在角膜移植术后免疫排斥过程中的效果及机制研究目的探讨针对p65低表达的慢病毒转染骨髓源性树突细胞对于同种异体大鼠正位穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的影响和作用机制。研究方法建立同种异体大鼠正位穿透性角膜移植模型,受体与供体大鼠分别随机分为四个实验组,分别于术前、术后注射骨髓源性树突细胞、慢病毒转染后树突细胞,术后观察移植植片的存活时间、角膜新生血管和角膜不透明度并建立评估体系；通过免疫组化染色分析角膜植片的病理变化和相关细胞因子的表达情况；通过流式细胞仪分析大鼠角膜移植术后脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+FoxP3+调节性T细胞的表达率；通过反转录聚合酶链式反应实验和酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中IL-10、IL-17和IFN-y的蛋白表达与mRNA表达水平。结果对照组中大鼠移植植片的平均存活时间为20±6.55天明显长于BMDC组的平均存活时间(13.47±2.56天),Lv-p65-DC组和Lv-p65-DC-cont组的大鼠移植植片的平均存活时间都超过30天；BMDC组的不透明度从术后的第12天开始明显高于其他三组(p<0.05),在术后第三周,Lv-p65-DC组分别低于或高于对照组和Lv-p65-DC-cont组；术后第10天,Lv-p65-DC-cont组的新生血管评分显著低于其余三组；免疫组化实验结果表明IL-17的表达具有特异性,并明显富集于角膜新生血管壁周围；BMDC组和对照组的调节性T细胞表达率明显高于其他两组；术后第三周,Lv-p65-DC组的p65 mRNA和蛋白表达水平明显高于Lv-p65-DC-cont组；在术后第一周,对照组的IL-10 mRNA和蛋白表达水平明显高于其他三组,术后第三周开始,对照组和Lv-p65-DC组的IL-10mRNA和蛋白表达水平明显高于Lv-p65-DC-cont组；IL-17和IFN-y的mRNA和蛋白表达特征较为近似,术后第一周,Lv-p65-DC组和Lv-p65-DC-cont组的mRNA和蛋白表达水平均明显低于BMDC组和对照组；术后第三周开始,对照组和Lv-p65-DC组的mRNA和蛋白表达水平都明显高于Lv-p65-DC-cont组。结论未经慢病毒转染的骨髓源性树突细胞在进入受体大鼠体内后受到炎症信号影响逐渐向成熟树突细胞分化,增强了术后的免疫排斥反应。大鼠角膜移植术前注射慢病毒转染的树突细胞可以诱导调节性T细胞活化,延长植片的存活时间并减轻移植术后角膜新生血管的生成和降低植片的不透明度。针对p65低表达的慢病毒可以降低术后IL-10、IL-17和IFN-γ的表达水平,同时慢病毒转染后树突细胞注射诱导大鼠角膜移植免疫耐受的治疗方式具有时间依赖性。