阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统变性疾病,以进行性多项认知损害为主要表现的综合征。患者脑中三大病理特征为淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经纤维缠结及神经元丢失。近年来细胞内Aβ、线粒体功能紊乱在AD发病中的作用已成为研究热点。淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)位于线粒体基质,催化醛、酮、醇及类固醇等的氧化或还原。Aβ存在时,Aβ可与ABAD结合,使后者构象改变,引起细胞内氧化应激可致细胞死亡。而无Aβ环境下,ABAD在应激情况下对机体有保护作用。为更好研究ABAD与Aβ结合后在AD发病中的作用及ABAD本身的生理作用,建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基础。目前已成功新建立神经元内选择性ABAD基因敲除小鼠模型。本实验对该小鼠一般性状、特征,及线粒体功能,且对于引起人类MHBDD疾病的ABAD三个突变位点进行了初步的研究,为ABAD在线粒体内的功能提供一些线索。第一部分选择性ABAD基因敲除对小鼠神经细胞及其线粒体功能影响的初步研究目的：选择性神经元内ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型,需要明确其基本特征及神经细胞线粒体功能。探索神经元内ABAD表达量下降导致线粒体功能紊乱的可能原因。方法：使用CREB PCR及FLOX PCR鉴定ABAD ko小鼠基因型。使用westernblot及免疫荧光染色鉴定ABAD在其大脑皮层及海马表达量。TMRM荧光染色了解线粒体膜电位变化,MitoSOX荧光染色观察线粒体氧自由基的释放,用ATP试剂盒测定脑组织ATP含量,TUNEL试剂盒染色观察神经细胞凋亡情况。免疫荧光染色及Western blot观察MHB、CypD及其它多种蛋白表达量的改变。用ImageJ对Western blot条带及荧光染色进行量化,通过标准曲线换算ATP脑组织含量,对TUNEL阳性的细胞及神经元进行计数等,用student t test比较基因敲除小鼠与对照小鼠的差异。结果：ABAD ko小鼠基因型为CREB(+)且FLOX Δneo。Western Blot结果提不ABAD ko小鼠皮层及海马ABAD的表达量明显下降,密度值分别为皮层0.81±0.129vs.0.29±0.031, P=0.00098,海马1.74±0.144vs.1.00±0.160,P=0.01894。免疫荧光染色提示ABAD ko小鼠上述部位ABAD表达量下降。MHB染色发现ABAD ko小鼠皮层MHB较wt小鼠明显增多,密度值为11.14±0.609vs.6.92±0.354,P=0.018,海马中ABAD ko小鼠MHB密度值较wt小鼠高,但P=0.48,无统计学差异。ABAD ko小鼠内嗅皮层中TMRM染色明显减低(1.00±0.081vs.0.75±0.049,P=0.036),运动感觉皮层无明显降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠内嗅皮层中明显升高(1.00±0.062vs.1.37±0.085,P=0.004),而在运动感觉皮层无统计学差异(P=0.336)。脑组织ATP含量测定ABAD ko小鼠数值相对低,但两组小鼠无统计学差异,可能取脑时间及部位不同影响结果(wt小鼠脑ATP含量2.54±0.282,ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210,P=0.264)。TUNEL染色发现7-8月ABAD ko小鼠皮层及海马均有TUNEL阳性细胞,较对照组明显升高,且内嗅皮层区神经元与总神经细胞比值明显下降,提示有神经元丢失(ABAD ko小鼠内嗅皮层神经元与总细胞比值0.298±0.069,wt小鼠0.67±0.050,P=0.032),而3-5个月的ABAD ko及wt小鼠大脑皮层或海马中均无TUNEL阳性染色,且皮层运动感觉区及内嗅皮层均无明显神经元丢失。另外Westernblot结果发现CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠脑组织中明显升高,COXIV、PSD95、Synaptophysin等表达量明显下降。结论：ABAD ko小鼠的基因型为CREB(+)且FLOX Δneo,皮层及海马神经元中ABAD表达量明显降低,其底物MHB在上述部位堆积,为导致下游膜电位下降,ROS增多及细胞凋亡的原因之一。ABAD ko小鼠脑中CypD表达量升高,可能为导致线粒体功能紊乱的另一原因。ABAD ko小鼠大脑皮层中内嗅皮层损伤严重。GFAP, SODII,Nrf2表达量上升,可能与星形胶质细胞增生对抗细胞内氧化应激有关,PSD95、Synaptophysin表达量降低,提示突触功能受影响。第二部分ABAD及三种突变体对氧化应激损害反应的研究目的：人类疾病MHBDD是由ABAD基因某些位点的点突变引起。既往认为是突变造成ABAD对MHB酶活性下降导致MHB在脑内堆积引起发病,而最近有报道认为还有其它途径损伤线粒体。因此,本研究建立空载体转染、wtABAD转染及三个mutABAD转染的稳定细胞系,观察wtABAD及三种突变体对氧化应激损害的反应,研究ABAD突变引起线粒体功能紊乱的可能途径。方法：建立稳定表达的空载体,wtABAD,三个mutABAD(R130C, D86G, Q165H)的SK-N-SH细胞系。用Western blot检验ABAD表达量,AEC染色鉴定细胞形态及纯度。选出合适的克隆后,加入H12O2诱导氧化应激,用MTT试剂盒、ATP试剂盒,测定各个细胞系中细胞的存活、生长及细胞内ATP含量的变化。两组间MTT数值及ATP含量差异用student t test检验。结果：wtABAD组与空载体转染的对照相比,H2O2处理24小时浓度为25uM,50uM,100uM组及处理48小时浓度为25uM,50uM组,MTT值明显升高(P<0.05)。wtABAD转染的ABAD表达量不同的克隆里,对氧化应激均具有明显保护作用,且ABAD表达量低,保护作用相对好,H2O2浓度高时保护作用更明显。mutABAD组里,100uM H202处理细胞24小时后MTT发现,R130C及Q165G组MTT值与对照相比无统计学意义差异(R130C:0.80±0.033VS.0.73±0.059,P=0.340:Q165H:0.80±0.033VS.0.89±0.050.P=0.162),D86G组数值明显下降(0.80±0.033VS.0.48±0.011,P=O.011).250uM H202处理细胞24小时后MTT发现,D86G.R130C数值明显下降(D86G:0.50±0.076vs.0.08±0.002,P=0.001;R130C:0.50±0.076vs.0.15±0.021,P=0.001),Q165H数值上升(0.50±0.076vs.0.69±0.019,P=0.030)。ATP结果提示H2021O0uM,200uM处理24小时后,对照组ATP含量较wtABAD组明显降低(100uM:0.90±0.086vs.1.18±0.079,P=0.036;200uM:0.66±0.071vs.1.07±0.092,P=0.006).50uM H202处理,wtABAD至48小时ATP含量无明显下降,而对照组ATP含量明显下降(24hr:1.01±0.066vs.0.95±0.081,P=0.391;48hr:0.83±0.032vs.1.05±0.071,P=0.036).而三个mutABAD组,100uM及200uM H2O2处理细胞24小时后测定ATP发现,ATP值与对照相比均无明显升高。结论：H2O2引起的氧化应激情况下,wtABAD转染SK细胞克隆对细胞均有保护作用,而三种mutABAD转染的细胞,MTT结果提示D86G、R130C可能对细胞存在进一步损伤作用,Q165H可能存在保护作用,ATP含量同对照组无明显差异。推测突变通过影响其它底物酶活性或CypD相关途径对线粒体功能产生损害,需要进一步实验证实。