研究目的急性白血病是一种严重危害人类健康的血液肿瘤。恶性肿瘤表现出来的耐药性一直是治疗失败的主要原因。其中P-gp介导的MDR是肿瘤耐药性的主要机制。逆转MDR可以使化疗失败的机率下降,具有很高的临床价值,已成为目前国内外化疗药物研究的重要方向之一。已发现的多种逆转剂缺乏肿瘤细胞识别特异性,会导致化疗药物药动学发生改变,增加毒性,如药物清除率下降、半衰期延长、血液浓度增高、分配体积增加等,这些都会增加对正常组织的毒性。植物来源的药物资源丰富,作用靶点多,具有高效低毒的优点,显示其在逆转MDR方面有较好的应用前景。本研究应用大蒜素提取物DATS处理K562/A02细胞,观察其对阿霉素的耐药逆转作用,评价DATS与小剂量维拉帕米合用逆转耐药的效果极其毒性作用,并就其逆转作用的分子机制进行深入探讨。研究内容和方法1.甲基四唑蓝（MTT）法增殖抑制实验1.1测定DATS（?）VRP对细胞的毒性作用,药物对细胞生长抑制率（%）=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%,根据线性回归方程求得10%的细胞生长受到抑制所需药物浓度（IC10）。选取DATS和VRP分别低于各自IC10的一个浓度,作为下述实验所需安全浓度,并测定二者以此浓度联合应用对K562/A02细胞生长的抑制率。1.2测定不同剂量的DATS联合阿霉素（ADM）对K562/A02细胞抑制率的量效和时效关系对照组加入终浓度为5ug/ml的ADM,实验组加入终浓度为5ug/ml的ADM和不同浓度的DATS,培养24、48、72小时后,上酶标仪测定A值。计算不同作用时间不同剂量的DATS和ADM联合作用对细胞的生长抑制率。1.3测定逆转剂对细胞药物敏感性的影响：加入不同浓度ADM培养48小时后,计算阿霉素对对照组和各加药组细胞的半数抑制浓度（IC50）。耐药倍数=耐药株IC50/敏感株IC50;逆转倍数=耐药株IC50/加逆转剂后IC50。2.光镜下细胞形态的改变取对数生长期的K562/A02细胞制成浓度为1×105/mL的细胞悬液,接种于预先铺置无菌盖玻片的24孔培养板内,分组为：①K562/A02,②K562/A02+ADM③K562/A02+DATs+ADM②、③组内均加入终浓度ADM1μg/mL,③组加入IC10浓度的DATS.在37℃,5%C02,及饱和湿度下培养24、48、72小时后,用HE法染色,光镜下观察,拍照。3.流式细胞术检测细胞内ADM浓度取对数生长期的K562和K562/A02细胞,实验分组：①K562②K562/A02③K562+ADM④K562/A02+ADM⑤K562/A02+DATS+ADM⑥K562/A02+VRP+ADM⑦K562/A02+DATS+VRP+ADM以⑥组作为阳性对照,以④组作为阴性对照.DATS和VRP终浓度为IC10所需浓度。调整各组细胞浓度为1×105/mL,分别加入DATS或VRP培养48h后,③-⑦加入终浓度为5μg/mL的ADM,再共同培养2小时利用ADM自身荧光的特性,经FCM检测对照组和各加药组细胞内ADM荧光强度。4.流式细胞术检测细胞膜P-gp取对数生长期的K562和K562/A02细胞,使其浓度为1×105/mL,分为①K562组②K562/A02组③K562/A02+DATS组④K562/A02+VRP组⑤K562/A02+DATS+VRP组每组平行3瓶。DATS和VRP终浓度为IC10所需浓度。对照组和各加药组细胞在37℃,5%C02,及饱和湿度下培养48小时。加入藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人P-gp单抗P-gp-PE和同型对照IgG2a-PE6μ1,用流式细胞术检测细胞膜P-gp。5.流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的K562/A02细胞,使其浓度为1×105/mL,；接种于50ml培养瓶中。分组：①K562/A02组②K562/A02+DATS组③K562/A02+VRP组④K562/A02+DATS+VRP组每组平行3瓶。DATS和VRP终浓度为IC10所需浓度。对照组和各加药组细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养48小时。加5μlAnnexin V/FITC和10μ1（20μg/ml）的PI溶液,用流式细胞仪检测细胞凋亡,FACS软件分析数据。右下象限是Annexin V+PI一细胞为早期凋亡细胞。6. RT-PCR检测基因的改变取对数生长期K562/A02细胞,分别用含10%灭活新生牛血清的RPMI-1640稀释成1×105/mL,接种于50ml培养瓶中,实验分为①K562组②K562/A02组③K562/A02+DATS组④K562/A02+VRP组⑤K562/A02+DATS+小剂量VRP组⑥K562/A02+DATS+VRP组,每组平行3瓶。DATS和VRP终浓度为IC10所需浓度。小剂量VRP终浓度为1/2IC10所需浓度。在37℃,5%CO2,及饱和湿度下培养48小时。采用半定量逆转录聚合酶链反应,检测各组细胞多药耐药基因mdrl及凋亡相关基因Bcl-2. Bax、 Caspase-3,和NF-K B/p65、IκBα的mRNA表达7. Western blot检测蛋白在细胞膜上的表达取对数生长期K562/A02细胞,分别用含10%灭活新生牛血清的RPMI-1640稀释成1×105/mL,接种于50ml培养瓶中,实验分为：①K562组②K562/A02组③K562/A02+DATS组④K562/A02+VRP组⑤K562/A02+DATS+小剂量VRP组⑥K562/A02+DATS+VRP组每组平行3瓶。DATS和VRP终浓度为IC10所需浓度。小剂量VRP终浓度为1/2IC10所需浓度。在37℃,5%C02,及饱和湿度下培养48小时。各组细胞提取细胞总蛋白,经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,以鼠抗人Mdr-1抗体、兔抗人NF-K B/p65抗体、鼠抗人IκBα抗体、兔抗人Caspase-3蛋白单克隆抗体作为一抗,二抗为HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗兔IgG,,DAB显色,扫描结果,以密度值反应蛋白表达量。9.统计学处理实验数据以均数±标准差表示,采用SPSS17.0软件进行统计学分析处理。实验组与对照组之间采用t检验,多组间的比较采用单向方差分析的方法。析因设计资料采用双因素分析方法,并绘制交互作用图,若两条线是平行的,则说明没有交互作用。P<0.05则认为差异有统计学意义。结果1.MTT检测结果DATS和VRP对K562/A02细胞的IC10分别为2.31±0.22μmol/L和4.03±0.13μg/m1。选择DATS2μmol/L、VRP4μg/ml作为安全范围药物剂量用于下面的实验。以此浓度的DATS和VRP联合作用于K562/A02细胞,培养48小时后,细胞的生存率为：92.72±3.26%。两药合用毒性并无相加。不同剂量的DATS联合阿霉素（ADM）对K562/A02细胞抑制率的具有量效和时效关系。DATS单药时对K562/A02细胞耐药逆倍数为3.789,VRP单药时对K562/A02细胞耐药逆倍数为12.31,联合应用（2μg/m1）VRP和DATS的逆转倍数为12.21,联合应用（4μg/m1）VRP和DATS的逆转倍数为34.38,证明DATS和VRP联合应用可以增加逆转作用,且小剂量VRP和DATS联合应用可以达到大剂量VRP单药的逆转效果。2.光镜下细胞形态的改变未加入逆转剂时,K562/A02细胞增殖旺盛,核分裂像多见。单独应用ADM（1μg/mL）作用48小时,K562/A02细胞增殖率抑制不明显。K562/A02+ADM+DATS组培养24小时,细胞数目明显减少,核分裂像少见。继续培养48小时后,部分细胞被裂解成数个大小不等的小体,细胞体积缩小,染色质凝聚附在核膜周边,嗜碱性增强,细胞核固缩呈均一的致密物,可见凋亡小体,部分核碎裂。72小时后,细胞数目更少,凋亡细胞比例增加。3.流式细胞术检测细胞内ADM浓度：K562细胞和K562/A02细胞内自身荧光强度很弱,分别为0.36±0.13和0.59±0.04。K562细胞经ADM处理后,细胞内ADM荧光强度为4.24±0.15,K562/A02细胞经ADM处理后,细胞内ADM荧光强度为2.49±0.27,与K562细胞比较有显著性差异（P<0.01）。加入DATS或VRP后,K562/A02细胞中的ADM荧光强度比加药前明显增强（P<0.01）。各加药组间相比无显著性差异。4.流式细胞术检测细胞膜P-gp：K562细胞P-gp表达率极低（0.53±0.07）,K562/A02细胞P-gp表达率高（9.16±1.27）,与K562细胞有显著性差异（P<0.01）。加入逆转剂DATS或VRP后,K562/A02细胞的P-gp表达率明显降低（P<0.01）。各加药组间无显著性差异。5.流式细胞术检测细胞凋亡K562/A02细胞的自然凋亡率是0.90±0.17%,加入DATS后凋亡率为12.15±0.78%,加入VRP后凋亡率为11.55±1.91%,两药合用时凋亡率为12.55±0.64K562/A02组和各加药组间均有显著性差异（P=0.000）。各加药组间无显著性差异。6. RT-PCR检测基因的改变K562/A02组的NF-KB/p65表达明显强于K562组（P<0.05）。各加药组均可以明显减弱K562/A02细胞的NF-KB/p65表达。（P<0.01）。K562组细胞的IκBα表达明显高于K562/A02组细胞。DATS、VRP单独使用对提高K562/A02组细胞IκBα的表达作用不明显（P=0.4,0.133）。两药合用效果优于单药（P<0.05）。DATS对Bcl-2（P=0.166）、Bax（P=0.062）的表达作用不明显。K562/A02细胞mdr-1表达明显高于K562细胞（P=0.000）。各加药组均可明显减弱K562/A02细胞的mdr-1表达（P<0.05）。K562细胞Caspase₃表达明显高于K562/A02细胞（P=0.000）,各加药组均可以明显增加K562/A02细胞的Caspase₃表达（P<0.01）。7. Western blot检测K562/A02细胞膜上蛋白表达的变化：K562细胞NF-KB/p65表达率明显弱于K562/A02细胞（P<0.01）,各加药组均可以明显减弱K562/A02细胞的NF-κB/p65表达（P<0.01）。K562细胞IκBα表达明显强于K562/A02细胞（P<0.05）。DATS、VRP单用对IκBα增强作用不明显（P=0.445,0.117）,两药合用效果优于单药（P<0.05）。K562细胞mdr-1表达明显弱于K562/A02细胞（P=0.000）。各加药组均可明显减弱K562/A02细胞的mdr-1表达（P<0.05）。K562细胞的Caspase₃表达明显高于K562/A02细胞（P<0.05）,各加药组均可以明显增加K562/A02细胞的Caspase₃表达（P<0.05）。结论1.大蒜素DATS具有逆转K562/A02细胞耐药的作用,与VRP合用时具有协同作用。2. DATS的这种逆转作用是通过减弱mdr-1基因的表达减少化疗药物外排和激活Caspase-3表达促进凋亡而实现的。3. NF-κB通路参与了上述基因的调节过程。