玉米转基因体系的优化及抗矮花叶病基因的转化

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玉米(Zea mays L.)是目前世界上产量最高的禾谷类粮食作物,具有粮食、饲料、工业原料等多种用途,在农业生产中占有重要的地位。玉米矮花叶病是一种世界性病害,而玉米对矮花叶病毒的抗性受微效多基因控制,遗传基础复杂,给利用玉米抗矮花叶病基因培育抗病品种带来了一定的困难。利用基因工程手段导入外源抗病基因,获得抗病毒的玉米种质材料,是培育抗病品种的有效途径。为打破基因型限制,建立玉米转基因优良的受体系统,优化玉米遗传转化体系,本研究以幼胚培养能力差异较大的郑58(好)和昌7-2(差)为材料,对外植体(幼胚)及愈伤组织诱导形成过程中的内源激素进行了分析,旨在探索其对胚性愈伤组织形成的影响;利用自交系E28的胚性愈伤组织,对农杆菌和基因枪介导转化体系进行了优化,并成功将抗矮花叶病毒基因导入到E28,郑58和齐319等三个自交系材料。主要研究结果如下:1.探索了影响玉米胚性愈伤组织诱导的关键激素。结果表明,不同大小外植体(即幼胚大小)激素含量有着较大差异,较低的ABA和GA3/Z有利于愈伤诱导的启动;愈伤组织形成初期(幼胚长芽阶段),较高的ABA和较低的GA3可以抑制芽的生长而促进愈伤组织的形成;去芽后,愈伤组织快速生长,此阶段较高的IAA/ABA更有利于胚性愈伤组织的形成;当胚性愈伤组织形成后,较高水平的IAA,Z以及IAA与Z的平衡对维持愈伤组织的良好胚性具有重要的作用。2.以E28的胚性愈伤组织为受体,对农杆菌介导中的浸染强度,共培养温度以及使用表面活性剂等进行了优化,对基因枪转化中的轰击压力与轰击距离进行了优化,并对两种转化方法进行了比较。结果表明:农杆菌介导法以OD600=0.6,浸染30min,25°C共培养3天,并加入0.01%的silwet L-77为最佳参数。基因枪轰击法为真空度为-0.095MPa时,4.5MPa,11cm轰击距离最合适。比较发现,基因枪轰击法的成功率大于农杆菌介导法。3.以优化的基因枪体系对自交系E28、郑58、齐319进行了抗矮花叶病毒基因的遗传转化,共得到目的基因和bar基因检测均为阳性的植株28株。经田间人工接种SCMV病毒鉴定,转基因后代表现不同程度的病毒抗性,并得到2个材料(郑58和齐319转化pCAMBIA3301-CNSP载体各1个)田间抗性性状和6个材料(1个郑58转化pCAMBIA3301-CNSP载体、1个齐319转化pCAMBIA3301-CNFP载体、4个齐319转化pCAMBIA3301-CNSP载体)PCR检测结果符合孟德尔分离规律,为玉米抗病育种提供了新的种质资源。
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