肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一类重要的胞浆衔接蛋白，它们参与多个细胞内信号转导通路，引发相应的基因活化，其中最主要的是引起NF-κB和JNK的活化，从而调节正常和肿瘤细胞的增殖、存活、凋亡并诱导内皮细胞出芽等。迄今为止共发现7种TRAFs家族成员，参与多个细胞内信号转导通路的活化，免疫共沉淀试验表明，刺激TNF家族受体可诱导TRAF4/p70S6K复合物的形成，TNF通过TRAF4使S6蛋白发生磷酸化，进而激活p70S6K，即TRAF4起到抑制调亡的作用；其中TRAF2是TRAF家族的核心成，主要参与TNFR家族的信号传导。TRAF4是TRAF家族中唯一在细胞核表达尚未见与其它TRAF家族成员相互作用的报道。　　 本实验主要应用基因的转染／干扰，免疫荧光染色／激光共聚焦，免疫共沉淀，Western Blot，，流式细胞计量(FCM)方法研究TRAF2在乳腺癌细胞中影响TRAF4核浆穿梭及其生物学功能分析。　　 材料与方法:　　 1、材料　　 正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，人雌激素受体依赖性乳腺癌细胞系MCF-7（低转移），人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231（中转移）和MDA-MB-435s（高转移）。　　 2、方法　　 (1)细胞培养：正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，，低转移性乳腺癌细胞系MCF-7以及中转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-435s。　　 (2)免疫荧光染色：检测TRAF2与TRAF4的核浆定位及其共定位。　　 (3)转染：按照LipofectAMINE2000说明书操作。　　 (4)免疫共沉淀：检测TRAF2与TRAF4的结合状况。　　 (5)应用Western blot方法检测转染TRAF2前后，TRAF4的变化：检测干扰TRAF2前后TRAF4的变化。　　 (6)应用流式细胞仪检测转染和干扰TRAF4后，细胞的侵袭性改变。　　 结果:　　 1、免疫荧光染色显示TRAF2与TRAF4在MCF-7细胞中的定位及在胞浆中的共定位　　 在MCF-7细胞中可看到TRAF2在细胞浆中阳性表达，呈现胞膜胞核红色荧光染色；TRAF4在胞膜胞浆及胞核中均呈现绿色荧光表达；通过激光共聚焦显微镜可以观察到TRAF2与TRAF4共定位于细胞浆中，呈现黄色荧光显色。　　 2、免疫共沉淀检测TRAF2和TRAF4在乳腺癌细胞系中的结合情况　　 TRAF2与TRAF4在MCF-10A（正常）、MCF-7（低转移）MDA-MB-231（中度转移）、MDA-MB-435s（高转移）四种细胞系中均结合。　　 3、通过Western-blot的方法，TRAF2在乳腺癌细胞中影响TRAF4的核浆穿梭　　 在干扰了TRAF2的MDA-MB-231（中度转移）细胞系中，TRAF4的核蛋白表达量增高，而胞浆中TRAF4的表达量降低；在转染了TRAF2的MDA-MB-231（中度转移）细胞系中，TRAF4的核蛋白表达量降低，而胞浆中TRAF4的表达量增高。　　 4、TRAF4对细胞生物学影响，转染了TRAF4后对细胞的凋亡起抑制作用　　 流式细胞仪检测结果显示：转染了TRAF4的MDA-MB-231细胞凋亡率1.73％低于正常MDA-MB-231细胞凋亡率为2.26％。表明转染TRAF4质粒可抑制乳腺癌细胞凋亡；干扰TRAF4后MDA-MB-231细胞凋亡率9.95％高于正常MDA-MB-231细胞凋亡率为2.26％，表明TRAF4可抑制乳腺癌细胞凋亡。　　 结论:　　 1、在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A及乳腺癌各种侵袭度的细胞系中TRAF2与TRAF4均可以结合。TRAF2主要表达与细胞胞浆及包膜中，而TRAF4在细胞核与细胞浆中均有表达；免疫荧光／激光共聚焦显示TRAF2与TRAF4在胞浆中有共定位表达。　　 2、我们在于扰了TRAF2后，对MDA-MB-231（中转移）细胞系中的核浆蛋白分离后测定TRAF4核浆蛋白的表达量，TRAF4的核表达量明显增高，而浆表达量明显下调；在对MDA-MB-231乳腺癌细胞系进行转染TRAF2后，通过western-Blot实验，发现TRAF4的核表达量下调而浆表达量提高。而前期实验证明TRAF4随侵袭性增加而核内蛋白表达量降低，故推测TRAF2与TRAF4结合促进细胞的凋亡。　　 3、TRAF4对于乳腺癌细胞有抑制细胞凋亡的作用，在转染了TRAF4以后，乳腺癌细胞的凋亡率降低了；在干扰TRAF4后乳腺癌细胞的凋亡率明显升高了。