目的本研究旨在采用分子对接技术探讨药膳神仙粥活性成分与免疫系统信号通路相关靶点的作用方式,预测药膳神仙粥在防治慢性疲劳综合征(Chronic fatigue syndrome,CFS)中发挥免疫调节作用的潜在机制。同时,建立CFS脾肾阳虚证大鼠模型,根据分子对接实验结果检测相关指标,从靶点蛋白m RNA表达层面阐释药膳神仙粥对CFS脾肾阳虚证大鼠的免疫调节机制,为中医药治疗CFS提供证据支持。方法本研究分为分子对接实验和动物实验两个部分:1.分子对接实验从PDB数据库和NCBI蛋白数据库中查询NF-κB信号通路、Th信号通路关键靶点蛋白的晶体结构(对照受体)及对应的配体结构(对照配体)。从TCMID数据库、TCM@Taiwan数据库及国内外文献中筛选药膳神仙粥组方药理活性明确的化学成分(实验配体)。采用Discovery Studio 3.5分子对接软件处理对照受体、对照配体及实验配体后进行对接运算。以对照受体与对照配体结合的相对分值作为标准,评价各实验配体与对照受体的作用强弱,选择作用较强的受体所在的信号通路进行后续动物实验。2.动物实验适应性喂养1周后,将72只SD大鼠按随机区组法随机分为6组,即空白组、模型组、盐酸氟西汀组(阳性对照组)、神仙粥低剂量组、神仙粥中剂量组、神仙粥高剂量组,每组12只大鼠。实验包括造模、干预及评价三个阶段,持续8周:(1)造模:采用病证结合的造模方式进行造模。即除空白组外,其余5组每日交替进行1次力竭游泳和慢性束缚以建立CFS疾病模型,同时每日灌胃1次番泻叶水煎液以建立脾肾阳虚证候模型。具体实施:单号日期行力竭游泳(以鼻尖沉入水中10s不能浮出水面为力竭标准),双号日期行慢性束缚(时间为2～4h);番泻叶水煎液浓度为1g/ml,按大鼠体重1ml/100g标准灌胃。造模持续4周。4周后,通过力竭游泳实验、旷场实验评价CFS疾病模型是否构建成功;通过评估大鼠一般情况,测定体重、平均日进食量及饮水量的变化评价脾肾阳虚证候模型是否构建成功。(2)干预:造模成功后,6组大鼠均按1ml/100g/d标准进行灌胃(即每100g体重大鼠每日灌胃量为1ml),神仙粥低、中、高剂量组分别灌胃浓度为0.42g/ml、0.83g/ml、1.66g/ml的神仙粥,盐酸氟西汀组灌胃0.21mg/ml的盐酸氟西汀,空白组和模型组大鼠均灌胃生理盐水,1次/日,持续4周。(3)评价:干预过程中,每日观察大鼠一般情况,每周末采用一般情况半定量评分量表评估大鼠一般情况并测量体重,干预第4周末测量大鼠平均日进食量及饮水量。干预第1、2、3、4周末通过行为学测试(力竭游泳实验、旷场实验、鼠尾悬挂实验)评估大鼠疲劳程度变化。干预第4周末根据分子对接实验结果测定炎性细胞因子含量及信号通路中相关靶点蛋白的m RNA表达水平。结果1.分子对接实验根据文献及数据库资料,从药膳神仙粥组方中筛选出12个化学成分。经分子对接,NF-κB信号通路中靶点蛋白与药膳神仙粥化学成分的对接有效率为90.63%,一致性得分高于或等于阳性对照值的比率为66.67%。Th信号通路中靶点蛋白与药膳神仙粥化学成分对接有效率为75.00%,一致性得分高于或等于阳性对照值的比率为45.00%。2.动物实验干预结束,神仙粥低剂量组1只大鼠因灌胃操作不当死亡,共71只大鼠完成实验。具体实验结果如下:2.1造模结果2.1.1 CFS疾病模型评价造模4周后,造模各组力竭游泳实验结果、旷场实验结果分别与空白组比较,结果显示力竭游泳时间明显下降,水平运动次数、垂直运动次数、理毛次数显著减少,粪便个数增多,均有统计学差异(P<0.01)。2.1.2脾肾阳虚证候模型评价造模4周后,造模各组分别与空白组比较,一般情况半定量评分表得分增加,体重、平均日进食量及饮水量明显下降,均有统计学差异(P<0.01)。2.2干预结果2.2.1疗效评价(1)一般情况变化:(1)一般情况半定量评分表得分:干预第4周末,模型组与盐酸氟西汀组、神仙粥高剂量组比较,有统计学差异(P<0.01)。(2)体重:干预第4周末,模型组与盐酸氟西汀组、神仙粥中剂量组、高剂量组比较,均有统计学差异(P<0.05),盐酸氟西汀组与神仙粥中剂量组、高剂量组无统计学差异(P>0.05)。(3)平均日进食量及饮水量:干预第4周末,模型组与各干预组比较,均有统计学差异(P<0.01),盐酸氟西汀组与神仙粥中剂量组、高剂量组比较无统计学差异(P>0.05)。(2)行为学变化:(1)力竭游泳实验:干预第4周末,模型组与各干预组比较均有统计学差异(P<0.01),盐酸氟西汀组与神仙粥中剂量组、高剂量组比较有统计学差异(P<0.01),神仙粥低剂量组与中剂量组、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.01)。(2)旷场实验:干预第4周末,模型组水平运动次数、垂直运动次数、理毛次数及粪便个数分别与各干预组比较均有统计学差异(P<0.05)。(3)鼠尾悬挂实验:干预第4周末,除神仙粥低剂量组外,模型组挣扎时间、挣扎幅度与各干预组比较,均有统计学差异(P<0.01),盐酸氟西汀组与神仙粥各剂量组比较均无统计学差异(P>0.05)。2.2.2实验室检测(1)炎性细胞因子含量变化:(1)组间比较:干预后各组大鼠血清IL-1β含量(F=39.208,P<0.01)、TNF-α含量(F=5.213,P<0.01)比较,均有统计学差异。(2)组间两两比较:IL-1β含量:模型组与各干预组比较,均有统计学差异(P<0.01),盐酸氟西汀组与神仙粥各剂量组比较,均有统计学差异(P<0.01),神仙粥低剂量组与中剂量组、高剂量组无统计学差异(P>0.05),神仙粥中剂量组与高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05)。TNF-α含量:模型组与各干预组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),盐酸氟西汀组与神仙粥中剂量组、高剂量组比较,无统计学差异(P>0.05),神仙粥低剂量组与中剂量组、高剂量组有统计学差异(P<0.05),但中剂量组与高剂量组比较,无统计学差异(P>0.05)。(2)靶点蛋白m RNA表达水平变化:(1)组间比较:干预后,各组大鼠血清TAK1(F=11.491,P<0.01)、TAB(F=7.610,P<0.01)、IKKα(F=11.119,P<0.01)、IκBα(F=6.162,P<0.01)、NF-κBp65(F=5.381,P<0.01)m RNA表达水平比较,均有统计学差异,COX-2(F=1.213,P>0.05)m RNA表达水平无统计学差异。(2)组间两两比较:模型组TAK1、TAB、IKKα、IκBαm RNA表达水平与盐酸氟西汀组、神仙粥中剂量组、高剂量组有统计学差异(P<0.05),NF-κBp65 m RNA表达水平仅与盐酸氟西汀组、神仙粥高剂量组有统计学差异(P<0.05)。盐酸氟西汀组TAK1、IκBαm RNA表达水平与神仙粥各剂量组比较,均有统计学差异(P<0.05),TAB、NF-κBp65 m RNA表达水平与神仙粥中剂量组、高剂量组无统计学差异(P>0.05)。而模型组COX-2 m RNA表达水平与各干预组比较及各干预组之间比较,均无统计学差异(P>0.05)。结论1.分子对接实验药膳神仙粥组方有效化学成分与NF-κB信号通路中的相关靶点蛋白结合一致性评分较高,预测药膳神仙粥可能通过NF-κB信号通路在防治CFS中发挥免疫调节作用。2.动物实验(1)隔日交替进行1次力竭游泳及慢性束缚,同时每日灌胃1次番泻叶水煎液,持续4周可成功构建CFS脾肾阳虚证大鼠模型。(2)药膳神仙粥对CFS脾肾阳虚证大鼠一般情况、体重、脾肾阳虚证候及疲劳症状有积极改善作用。(3)药膳神仙粥可降低CFS脾肾阳虚证大鼠血清IL-1β、TNF-α浓度,对NF-κB信号通路中的TAK1、TAB、IKKα、IκBα、NF-κBp65的m RNA表达具有一定抑制作用,提示药膳神仙粥可通过阻滞NF-κB信号通路发挥CFS大鼠的免疫调节作用。