论文部分内容阅读
目的: 建立卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）大鼠模型，观察雌激素对缺血性PSD大鼠的抑郁样行为学的影响及其在海马中脑源性生长因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）、其受体酪氨酸激酶B(Tyrosine kinaseB，TrkB)及cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的信号通路蛋白表达水平的变化，探讨卒中后抑郁的分子机制。 方法: 1.选取36只Sprague-Dawley雌性大鼠(225-255g)，所有大鼠均行去卵巢手术，随机分为对照组、模型组和雌激素组。对照组，不给予其他刺激;模型组，应用大脑中动脉阻塞术(middle cerebral artery occlusion，MCAO)和不可预见的慢性温和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)2周，再皮下注射大豆油，持续2周;雌激素组，MCAO术后并CUMS2周，再给予10μg溶于0.1ml大豆油的雌激素干预2周。去卵巢1周后、CUMS2周后和雌激素干预2周后分别予旷场试验(open field test)、强迫游泳试验(forced swimming test)和糖水偏爱试验(sucrose preference test)以观察行为学变化。使用免疫组化和蛋白印迹的方法，观察雌激素对大鼠海马中BDNF/TrkB/CREB信号通路在的蛋白质表达变化。 2.通过切除大鼠的双侧卵巢，在采用经典的线栓法建立MCAO脑缺血模型，加用CUMS结合孤养，建立PSD大鼠模型。选取44只PSD雌性大鼠(230-255g)随机分为模型组(n=8)，雌激素组(n=8)，雌激素+K252a组(n=14)和雌激素+U0126组(n=14)。利用脑立体定位技术将TrkB的阻断剂K252a和pCREB的阻断剂U0126注入到侧脑室，同时注入等量的人工脑脊液(artificial cerebrospinalfluid，aCSF)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)作为对照。PSD大鼠在基线（0周）、雌激素干预1周和雌激素干预2周后分别予以糖水偏爱试验和旷场试验观察行为学变化。通过阻断TrkB和CREB的表达，使用蛋白质印迹方法观察雌激素对BDNF信号在海马中的蛋白质表达影响。 结果: 实验一 1.旷场试验行为学 旷场试验行为学结果:①MCAO术前（基线）各组大鼠旷场试验的水平活动和垂直活动的得分两两统计比较均无意义(P＞0.05);②持续两周的CUMS后，PSD模型结束，雌激素组与模型组的水平活动得分(P＜0.01)和垂直活动(P＜0.01)较对照组相比显著减少;③雌激素持续干预2周后，雌激素组的大鼠水平活动和垂直活动的得分与模型组相比，能显著逆转(P＜0.01)。 2.强迫游泳行为学 强迫游泳行为学结果:①MCAO术前（基线）各组大鼠强迫游泳测试挣扎时间和不动时间的差异无统计学意义（P＞0.05）;②CUMS结束后，PSD模型完成，与对照组相比，雌激素组与模型组的大鼠不动时间显著延长(P＜0.01)，同时挣扎时间显著下降(P＜0.01);③雌激素干预2周后，与模型组相比较，雌激素组的大鼠不动时间显著缩短(P＜0.01)，挣扎时间明显延长(P＜0.01)。 3.糖水偏爱试验行为学 糖水偏爱试验行为学结果:①MCAO术前（基线）各组大鼠糖水偏爱度无统计学意义(P＞0.05);②PSD模型结束，与对照组比较，雌激素组与模型组大鼠对糖水偏爱度均明显降低(P＜0.01);③雌激素持续干预2周后，雌激素组大鼠的糖水偏爱度有提高，有统计学差异(P＜0.01)。 4.免疫组化和蛋白质印迹结果 免疫组化结果显示:BDNF阳性神经元主要集中于海马等部位。BDNF蛋白主要分布在细胞的胞质，有一小部分在胞核表达。与对照组相比，模型组海马中BDNF阳性细胞数目减少(p＜0.05);在雌激素干预后，与模型组相比，雌激素组阳性细胞数增多(p＜0.05)。pCREB主要在海马区的DG区表达。模型组大鼠的pCREB在海马区的阳性细胞数与对照组相比明显减少(p＜0.05);雌激素干预后，雌激素组pCREB的阳性细胞数较模型组明显升高(p＜0.05)。 蛋白质印迹结果:BDNF/TrkB/CREB主要在海马区域的表达。模型组与对照组比较，BDNF/β-actin、pTrkB/TrkB和pCREB/CREB的灰度比值在海马区表达明显减少(p＜0.01)，经雌激素干预两周以后，雌激素组的BDNF/β-actin、pTrkB/TrkB和pCREB/CREB的灰度比值分别显著高于模型组(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。 实验二: 1.旷场试验行为学 旷场试验行为学结果:①PSD模型完成（基线）各组大鼠的水平活动和垂直活动得分两两相比均无统计学差异(P＞0.05);②雌激素干预1周后，雌激素+K252a组和雌激素+U0126组分别与雌激素组比较，水平运动得分和垂直得分均有减少，(P＜0.05);③雌激素干预2周后，雌激素+K252a组和雌激素+U0126组分别与雌激素组比较，水平运动和垂直运动的得分仍未改善(P＜0.05)。 2.糖水偏爱试验行为学 糖水偏爱试验行为学结果:①PSD模型完成（基线）各组大鼠糖水偏爱度两两比较无统计学意义(P＞0.05);②雌激素干预1周后，雌激素+K252a组和雌激素+U0126组分别与雌激素组比较，大鼠的糖水偏爱度显著降低(P＜0.05);③雌激素干预2周后，与雌激素组比较，雌激素+K252a组的大鼠糖水偏爱度有显著降低(P＜0.01)，雌激素+U0126组的大鼠糖水偏爱度有显著降低(P＜0.05)。 3.蛋白质印迹结果 蛋白质印迹结果:①向侧脑室分别注入K252a、U0126、人工脑脊液和DMSO后，K252a组和U0126组分别与人工脑脊液组相比，pTrkB/β-actin、TrkB/β-actin和pCREB/CREB的灰度比值水平均显著下降(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05);②雌激素+K252a组与雌激素相比，BDNF/β-actin灰度比值显著下降(P＜0.01);同时，雌激素+U0126组与雌激素组比较，BDNF/β-actin灰度比值显著下降(P＜0.05)。 结论： 1.采用经典的线栓法建立MCAO模型，加用CUMS结合孤养，通过行为学的评估，成功复制实验大鼠卒中后抑郁模型。 2.在PSD模型的基础上，给予雌激素干预后，多种行为学观察结果表明雌激素可以改善脑卒中大鼠抑郁样症状。 3.雌激素对PSD大鼠海马中BDNF/TrkB/CREB信号通路表达起到上调作用。通过阻断TrkB和CREB的表达，雌激素对激活BDNF的蛋白表达明显起到抑制作用，其行为学评分显著减少，间接表明了BDNF/TrkB/CREB信号通路存在内在相互联系，揭示PSD的分子机制之一。