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背景:目前的几项研究发现肺癌的进展受表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)二者之间信号通路交互作用的影响。同时针对EGFR和PKC的联合分子靶向治疗肺癌,可能产生叠加或者协同效应。本课题的目的是探讨联合应用EGFR抑制剂厄洛替尼(erlotinib)和PKC抑制剂白屈菜红碱(chelerythine chloride)治疗非小细胞肺癌细胞的可能性。材料和方法:SK-MES-1细胞株来源于人肺鳞状细胞癌,A549和HCC827细胞株来源于人肺腺癌细胞。SK-MES-1和A549细胞株为EGFR野生型,而HCC827细胞株是EGFR突变细胞株(酪氨酸激酶E746-A750缺失突变)。使用厄洛替尼和白屈菜红碱单药或联合治疗肺癌细胞系SK-MES-1、A549和HCC827。利用alamar blue测试药物对细胞增殖的影响,采用Bliss独立检测标准(Bliss independence criterion)和联合指数法(combination index,CI)两种方法判断厄洛替尼和白屈菜红碱两种化合物联合使用的效能。待联合用药的药物配伍浓度确定后,采用乳腺实验分组进行后续实验:对照组(加入DMSO,终体积为0.1%)、厄洛替尼单药组(SK-MES-1和A549细胞株终浓度均为5μM,终体积均为0.1%)、白屈菜红碱单药组(SK-MES-1细胞株为5μM,A549细胞株为7.5μM,终体积均为0.1%)、联合用药组(SK-MES-1细胞株:厄洛替尼终浓度5μM+白屈菜红碱终浓度5μM;A549细胞株:厄洛替尼终浓度5μM+白屈菜红碱终浓度7.5μM,药物终体积均为0.1%)。transwell实验检测单药、联合用药对细胞胞侵袭能力的影响,流式细胞仪检测单药、联合用药对细胞周期及凋亡的影响,western blot实验检测单药、联合用物对STAT3、ERK1/2、p-38 MAPK、BAD磷酸化水平的影响。体内实验:24只4-6周龄雄性NOD SCID(平均体重18-20g)小鼠在无病原体的饲养房中饲养。每只小鼠的左侧胸前皮下注射0.1ml含有4×106的SK-MES-1细胞的PBS细胞悬液。接种肿瘤细胞后,每天观察皮下肿瘤的形成情况。当肿瘤体积达到150 mm3时,开始药物治疗。24只小鼠被随机分为4组,每组6只:对照组(DMSO),厄洛替尼单药组(50mg/kg,日一次灌胃),白屈菜红碱单药组(10mg/kg,日一次灌胃),厄洛替尼(50mg/kg,日一次灌胃)联合白屈菜红碱联合治疗组(10mg/kg,日一次灌胃)。治疗开始后,每2天记录小鼠体重,观察接种部位肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,观察小鼠活动情况、有无脱毛、异常反应等情况。治疗14天后,小鼠用CO2窒息处死,分离肿瘤组织并称重,将肿瘤组织一部分保存于-70℃,另一部分10%甲醇固定后,石蜡包埋、切片、HE染色。检视小鼠胸腔、腹腔,观察是否有转移病灶。将小鼠心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、脑组织部分保存于-70℃,另一部分10%甲醇固定后,石蜡包埋、切片、HE染色。小鼠移植瘤模型体内验证药物对肺癌细胞增殖的影响。结果:厄洛替尼在HCC827细胞中的IC50值为131±1.01n M,而在SK-MES-1和A549细胞中的IC50值分别为43.42±4.35μM,49.88±0.47μM,说明SK-MES-1和A549细胞与HCC827细胞相比对厄洛替尼的敏感性较低(p<0.01)。与此相反,白屈菜红碱在HCC827细胞、SK-MES-1细胞、A549细胞中的IC50值分别为5.0±0.48μM,6.35±1.26μM和7.78±0.56μM,白屈菜红碱在三种细胞株中的IC50值比较无统计学差异。当厄洛替尼与白屈菜红碱联合用药时,可增强对厄洛替尼敏感性较低的SK-MES-1和A549细胞的抑制作用。与厄洛替尼或白屈菜红碱单独用药相比,厄洛替尼联合白屈菜红碱可明显抑制SK-MES-1和A549细胞活性,且这种效应体现为时间和剂量依赖性。SK-MES-1和A549细胞的CI指数分别为0.98和1.08。Bliss独立检测标准亦证实了白屈菜红碱对厄洛替尼低敏感性细胞的叠加效应。根据对细胞活性影响的效果,我们确定了后续实验的药物浓度:针对SK-MES-1细胞,药物浓度为5μM厄洛替尼联合5μM白屈菜红碱,针对A549细胞,药物浓度为5μM厄洛替尼联合7.5μM白屈菜红碱。此外,当10n M厄洛替尼联合2.5μM白屈菜红碱应用于HCC827细胞时,与对照组或单独用药组相比,肺癌细胞株活性受到显著地抑制。厄洛替尼联合白屈菜红碱对细胞增殖的影响能力通过后续的细胞克隆实验和细胞计数进行进一步确认。与对照组或厄洛替尼、白屈菜红碱单药组相比,联合用药组显著抑制了SK-MES-1和A549细胞的克隆形成能力,SK-MES-1细胞株各治疗组的克隆数平均值分别为43(对照组)、33(厄洛替尼单药组)、20(白屈菜红碱单药组)、6(联合用药组)(p<0.05);A549细胞株各治疗组的克隆数平均值分别为62(对照组)、49(厄洛替尼单药组)、21(白屈菜红碱单药组)、4(联合用药组)(p<0.05)。细胞计数提示,在24小时、48小时、72小时各时间点,与对照组或厄洛替尼、白屈菜红碱单药组相比,联合用药明显降低细胞增殖数量(p<0.05)。为了明确联合用药对肺癌细胞侵袭能力(迁移和浸润)的影响,我们采用transwell实验来观察细胞迁移和浸润能力的变化。联合用药组中,SK-MES-1细胞的相对迁移和浸润率平均值分别为11.67%和6.33%,A549细胞的相对迁移和浸润率平均值分别为8.00%和8.67%。与对照组或单药治疗组相比,联合用药显著降低了SK-MES-1和A549细胞的侵袭能力(迁移和浸润)。为探讨厄洛替尼和白屈菜红碱抑制细胞增殖的机制,我们采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。单药治疗或联合用药治疗24小时后,检测对照组、厄洛替尼单药治疗组、白屈菜红碱单药治疗组、厄洛替尼联合白屈菜红碱治疗组中SK-MES-1和A549细胞凋亡比率。SK-MES-1细胞中各组凋亡细胞比率分别为4.12%,8.11%,47.63%和66.90%。A549细胞中各组凋亡细胞比率分别为3.82%,4.97%,21.05%和40.83%。与对照组和单药治疗组相比,联合用药显著增加了细胞凋亡率(P<0.05)。为探讨厄洛替尼和白屈菜红碱对SK-MES-1和A549细胞EGFR信号通路的影响,我们采用蛋白电泳免疫印迹分析法(western blot)检测EGFR下游分子的磷酸化变化情况。厄洛替尼与白屈菜红碱联合用药组抑制了EGF诱导的STAT3,ERK1/2,p38 MAPK和Bad蛋白磷酸化。此外,各组细胞在生长培养基中治疗24小时后,联合用药组中PARP的表达量增加。SK-MES-1、A549和HCC827细胞均表达EGFR,且HCC827中EGFR表达量较高。我们应用小鼠移植瘤模型观察了厄洛替尼单药、白屈菜红碱单药以及联合用药组对SK-MES-1细胞小鼠皮下移植肿瘤生长的影响。厄洛替尼与白屈菜红碱联合用药治疗组,与其余各组比较,显著地抑制肿瘤生长。与对照组治疗终点肿瘤平均体积比较,p<0.01;联合用药组与厄洛替尼单药组比较,p<0.05。肿瘤重量明显减轻(p<0.05)。无论单药或是联合用药治疗组,与对照组相比,小鼠体重无明显变化,各治疗组重要器官组织病理学检查未见异常,提示小鼠对药物的耐受性良好。结论:我们的研究提示联合用药抑制EGFR和PKC通路在非小细胞肺癌治疗中的可能性,为非小细胞肺癌的治疗提供了一种新的策略。