【背景】胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率、死亡率呈逐年上升趋势,在我国发病率与死亡率均位居癌症总发病率和死亡率的第三位。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)被认为是胃癌的一类致癌因子,细菌毒力因子及引发的慢性炎症都参与了胃黏膜细胞恶性转化的过程。H.pylori单独的致癌性并不强,许多内外协同因素可能会增强H.pylori的致癌性,比如亚硝酸盐的协同作用。H.pylori感染与胃癌的关系以及H.pylori诱发胃粘膜上皮细胞恶性转变的细胞分子机制仍不明确。阐明H.pylori长期慢性感染的致病机制对于胃癌的早期预防、早期诊断和早期治疗具有重要意义。【目的】模拟H.pylori临床感染过程建立H.pylori慢性感染的胃黏膜上皮细胞模型和小鼠模型,探讨H.pylori慢性感染或协同亚硝基化合物(MNNG)诱导黏膜上皮细胞恶性转化的细胞分子机制。【方法】1以人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1为靶细胞,选取CagA~+H.pylori J99株单独或联合MNNG连续感染诱导12个月,建立H.pylori慢性感染细胞模型,光镜及电镜观察细胞形态变化;MTT比色法、细胞克隆形成、Annexin V/PI双染色法检测细胞增殖和凋亡;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;ELISA法检测IL-8的浓度;克隆球形成和细胞表面标志测定细胞的肿瘤干细胞(CSC)样和上皮-间质转化(EMT)样改变;实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色检测相关基因mRNA和蛋白质的表达。2以C57BL/6J小鼠为对象,使用CagA~+H.pylori SS1株单独或联合MNNG灌胃,反复感染胃黏膜12个月,建立H.pylori慢性感染动物模型,定期处死部分小鼠,采集胃黏膜标本和血清,快速尿素酶和Warthin-Starry银染色法观察H.pylori的感染状况;ELISA检测血清中IL-8的浓度;电镜和HE染色光镜观察胃黏膜组织形态学变化;Western blotting和免疫组织化学染色检测细胞增殖、细胞凋亡、EMT和CSC等相关蛋白的表达。3收集72例临床病理学明确诊断、手术切除的胃癌标本,获取胃癌组织和癌旁组织,快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色分为H.pylori感染组(40例)和H.pylori非感染组(32例)。HE染色光镜观察胃黏膜组织形态学变化,免疫组织化学染色检测胃癌和癌旁组织中IL-8和Wnt2表达。结合患者临床病理资料,分析H.pylori感染与临床表现、IL-8和Wnt2之间的相互关系;以生存曲线和生存回归分析H.pylori感染、IL-8表达、Wnt2表达与胃癌患者预后的相关性。【结果】1 CagA~+H.pylori长期慢性感染后,随着感染时间的延长,胃黏膜上皮GES-1细胞异常增殖、抵抗凋亡、耐药性增高、IL-8表达和分泌加强,迁移和侵袭能力增强,CSCs样和间质细胞样的标志物显著增高。同时,NF-κB和Wnt/β-catenin信号途径均被活化。联合应用MNNG可显著加强H.pylori慢性感染对GES-1细胞的诱导效应。提示在NF-κB和Wnt/β-catenin通路的共同调控下,CagA~+H.pylori长期慢性感染诱发胃粘膜上皮细胞发生CSC样和间质细胞样改变。2 CagA~+H.pylori SS1株能够成功感染小鼠胃黏膜,在H.pylori长期、反复、慢性感染刺激下,小鼠胃黏膜逐渐发生了异常增生、粘膜内囊肿及腺瘤样息肉变、癌前病变等病理学改变,IL-8表达和释放增高、炎性反应明显;Cyclin D1、Bcl2和Bax蛋白表达显示粘膜细胞异常增生和凋亡降低。同GES-1一样,小鼠胃黏膜上皮细胞CSCs样和间质细胞样的标志物增高,NF-κB和Wnt/β-catenin通路被异常激活。协同MNNG作用显著提高H.pylori的感染效应。提示CagA~+H.pylori长期慢性感染致小鼠胃黏膜Wnt/β-catenin/IL-8通路异常活化,粘膜细胞发生炎性反应、呈现CSC样、EMT样及癌前病变病理改变。3临床胃癌患者癌组织IL-8和Wnt2的表达明显高于癌旁正常黏膜组织,H.pylori感染胃癌组织IL-8和Wnt2的表达显著高于未感染者,且IL-8表达与Wnt2的表达呈正相关。早期及无淋巴结转移者IL-8和Wnt2表达阳性率均低于进展期及有淋巴结转移者;IL-8和Wnt2阳性表达的胃癌患者生存率显著低于阴性表达者。【结论】CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG激活胃黏膜细胞Wnt/β-catenin/NF-κB/IL-8调控通路,诱导胃黏膜上皮细胞异常增殖及肿瘤干细胞样和间质细胞样改变,促发胃黏膜炎性反应和癌前恶性转化。临床H.pylori感染阳性胃癌活化Wnt/β-catenin和NF-κB通路降低患者生存率。