论文部分内容阅读
目的:在哺乳动物细胞中验证NgAgo-g DNA系统是否具有基因编辑和调控基因表达的功能;对利用NgAgo-g DNA系统靶向致癌突变基因杀灭肿瘤细胞进行初步探索研究。方法:提取肿瘤细胞基因组DNA,通过PCR的方式扩增基因突变序列。将扩增片段克隆入T载体中,测序突变序列,鉴定肿瘤细胞系突变位点。构建致癌突变基因与EGFP共表达载体,将共表达载体、NgAgo载体以及靶向突变部位或EGFP的g DNA通过Lipofectamine 2000瞬时转染到293FT细胞中,流式检测EGFP的表达。以EGFP荧光表达率为指标判断基因编辑的效果。之后,探究在不同血清浓度(10%、5%、2.5%)及不同效靶比(EGFP:NgAgo-g DNA=1:3、1:6、1:12、1:24)条件下的基因编辑效果。随后,我们对实验条件进行优化。在进行基因编辑时,我们常使用EGFP作为报告分子。但由于EGFP蛋白相对稳定,降低了其对微弱基因编辑效果的报告敏感性。为此,我们的研究尝试构建EGFP-PEST融合蛋白表达载体,利用PEST序列可通过泛素蛋白酶体途径降解蛋白的功能,加快EGFP的降解,从而使得EGFP能够更为灵敏的指示基因编辑效果,为实现基因编辑的可视化筛选奠定基础。因此,以NFATx6-m Pro-EGFP-PEST-YES为模板,PCR扩增EGFP-PEST序列,克隆入逆转录病毒载体p QCXIP-EGFP-N1构建p QCXIP-EGFP-PEST-N1,病毒包装后感染293FT细胞获得稳定细胞系。用蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理细胞,Western Blot检测EGFP的表达变化。成功建立稳定表达p QCXIP-EGFP-PEST-N1的293FT后,将NgAgo的表达载体以及靶向EGFP的g DNA通过Lipofectamine 2000瞬时转染到293FT细胞中,流式检测EGFP的表达,分选出俩群差异表达EGFP的细胞,分别提取基因组DNA和RNA,PCR扩增基因突变部位,测序突变序列,逆转录RNA,利用q PCR检测RNA水平的表达。最后,利用脂质体Lipofectamine 2000将NgAgo以及靶向突变序列的g DNA转入到肿瘤细胞中,连续72小时监测肿瘤细胞增殖。结果:1.在我们所选择的肿瘤细胞系中,大部分细胞系均与文献报道的突变位点相符,仅H820细胞系并没有发现文献报道的T790M的突变。2.在不同血清浓度及不同效靶比条件下,NgAgo-g DNA系统靶向突变部位或EGFP后,EGFP的荧光表达率未见明显降低。3.瞬转靶向EGFP的NgAgo-g DNA到稳定表达EGFP-PEST的293FT细胞系中,通过流式分析发现EGFP的荧光表达强度有所降低,但基因序列分析未见DNA序列改变。4.NgAgo-g DNA系统可以靶向致癌突变抑制肿瘤细胞的增殖。结论:在哺乳动物细胞中,NgAgo-g DNA系统可以敲低基因表达,但基因编辑能力在本研究中未得到证实;基于NgAgo-g DNA系统治疗肿瘤值得进一步研究。