口腔颌面外科临床常常遇到因恶性肿瘤切除、外伤和修复前外科而造成口腔粘膜缺损需要修复的问题。传统上多采用皮肤和粘膜移植修复，但二者均存在着缺陷。移植的皮肤在口腔内仍保留着皮肤的原有功能和结构，出现诸如：角化、毛发生长、口腔内不适感。移植的粘膜虽更为接近生理要求，但其来源十分有限。而且两种修复方法均会在修复缺损的同时造成供区损伤。组织工程为口腔粘膜缺损修复开辟了新途径，即应用人体少量的组织细胞经体外培养扩增后接种在支架材料上，移植到组织缺损处恢复组织的完整性。组织工程粘膜为粘膜缺损修复提供了新的思路，避免了传统修复方法的缺点，有广阔的应用前景。本研究旨在对组织工程口腔粘膜的种子细胞-粘膜上皮细胞的生物学特性进行系统研究，分析影响细胞生长的因素，以提高培养成功率；在此基础上对组织工程粘膜进行了初步的实验研究。第一部分、人口腔粘膜种子细胞的研究1．人口腔粘膜上皮细胞的无血清培养及生物学特性的研究 取手术中切除的口腔粘膜，上皮分别用胰酶和中性蛋白酶（Dispase）分离后经胰酶消化成单细胞，接种于无血清培养基。将二者细胞数量、活力及融合时间加以比较，同时对细胞各代增殖特点、生长曲线、克隆形成率及血清对细胞分化的影响进行观察。Dispase分离法的细胞总数、细胞活力均高于胰酶分离法。粘膜上皮细胞能够在无血清培养基中稳定增殖传代，血清对上皮细胞有诱导分化作用。由Dispase分离的无血清培养技术可短期内获得大量具增殖能力的粘膜上皮细胞。2．口腔粘膜上皮细胞原代培养影响因素分析 将手术中获得的粘膜组织按不同的方法进行无菌处理；以不同的酶进行上皮分离和消化成单细胞。分别观察对原代培养成功率、细胞融合和活细胞率的影响，同时对上皮的来源对原代培养成功率也进行了分析。结果经洗必 第四军医大学博士学位论文 太和用含抗生素的培养基浸没3天均可明显降低原代培养的污染率，且不影 响细胞的活力；经Dispase分离的上皮获得更多数量的增殖细胞，细胞融合 时间缩短；在由上皮获取单细胞过程中胰酶肥DTA可以获得更多数量的活 细胞，对细胞的毒性最小。口腔粘膜上皮细胞原代培养经优化培养可获得较 高的成功率。 3．维甲刚口胺m上皮阅胞分化M节 取第H代粘膜上皮细胞以 4 x 104个Icm‘接种玻片上，在含钙 1．ZInM的 KS刚培养，将其按培养基中的RA浓度分为0、10‘M、10’M、10‘M。2 川 共5个实验组。对各组细胞进行硝酸银染色，观察核仁区相关嗜银 蛋白（AgNORS）的染朋况，并对细胞核 AgNORs面删行图像分析，以 评价细胞的增殖能力。同时对实验各组细胞bax表达进行免疫组化染色，观 察RA对细胞表达的调控。实验结果显示：RA的浓度在10“’M－10tw时在 高钙培养基中生长的细胞内 AgNORS面积与 RA为 0，10’M实峨的差别有 显著性意义，有效的阻止了培养基高浓度钙离子对细胞分化的诱导作用。Bax 表达结果表明：钙离子可以诱导凋亡相关基因bax的锄，而RA则可下调 其表达水平。实验结果提示：RA可有效地阻止钙离子诱导的分化，下调凋 亡相关基因bax的表达水平。 4．维甲回对口肛 钢胞内槽间钙的词节 将第二代口腔上皮细胞以 2 X 10VcmZ接种于激光共聚焦测试培养皿，细 胞贴朝，分别在低钙KS．09InM）和Caz＋浓度为1．ZInM的KSFM“中 继续培养12h。分别加人钙离子指示剂Fluo－3lAM负湘，加人10”’M的RA 在不同时段激光共聚焦显微镜下观察细胞内钙离子分布变化并进行定量分 析。结果显示：经含RA处理的高钙环境生长的细胞内钙含量明显减少，而 RA对正常KSFM中生长的细胞内孵量无明显影响。说明RA调节上皮 细胞分化的机制可能是通过减少细胞的钙内流而发挥作用。 ＄＝e、ffiNll8MNpeiffsfR 1．粕回复回上应的墙并和移桓m 实r择第二代口腔粘膜上皮细胞以 4 X 10Vcmz接种于培养皿，待细胞 3 第四军医大学博士学位论文 呈融合状态后，换用钙浓度为 IInM的 KSFM，继续培养约 1周左右即形 成复层上皮。用Dispase消化将上皮从培养帼起，基底细胞面朝上放在凡 士林油纱上，将之转移至裸鼠背部 Zcm x Zcm的皮肤缺损处。术后 15d处死 动物并取材进行组织学和免疫组化学观察。结果表明：术后 15d创面处形成 复层上皮，兔疫组化染色显示新形成的上皮呈HLA－ABC阳性。提示培养的 粘膜上皮