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狂犬病是由狂犬病毒引起的高度致死性和接触性人兽共患病,几乎所有哺乳动物均可感染,一旦发病就意味着死亡。我国是狂犬病高发国家之一,加之疆土幅员辽阔,狼、狐狸等野生动物携带狂犬病毒的可能性较大,因此牧区牛羊受野生动物攻击而感染狂犬病的情况时有发生,如山西、内蒙、新疆塔城等地均有牛羊被其咬伤导致其感染狂犬病的报道。羊痘病毒作为痘病毒科的成员,是大型的线形DNA病毒,可容纳大量外源基因而不影响病毒的正常生长繁殖,因此常被作为载体生产活载体多价疫苗。为有效预防羊狂犬病,本研究以山羊痘病毒疫苗株为病毒活载体,以其腺甘酸酶基因(TK)为复制非必需区,以VV7.5基因或GTPV-A8R基因为启动子,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用基因工程技术设计构建10株能重组狂犬病毒保护性抗原(G蛋白)的表达载体;制备培养羔羊睾丸原代细胞,通过脂质体转染法将构建成功的重组表达载体导入预先感染羊痘病毒疫苗株的羔羊睾丸细胞中,经同源重组获得能够表达狂犬病毒G蛋白的重组羊痘病毒,然后运用低熔点琼脂糖固定、挑取荧光斑点和倍比稀释传代的方式进行纯化,经4-6代传代纯化即可获得较纯的重组病毒,通过GFP基因表达率、细胞病变及PCR方法确定重组病毒是否纯化,并运用Western-blot方式初步评价G蛋白在重组病毒中的表达效果。用ELISA方法检测培养物中G蛋白的表达情况。将纯化的重组疫苗株免疫健康绵羊,定时采血分离血清,通过ELISA方法初步评价狂犬病毒G蛋白产生的抗体水平,并用羊痘病毒疫苗株对对照。本试验成功构建8株重组病毒转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PG M-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFPRVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP。制备羔羊睾丸原代细胞,其生长稳定性较好且接种羊痘病毒后细胞病变明显,可以满足后期实验需要。经细胞转染、基因重组、重组病毒筛选纯化,得到PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PG M-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP 3株重组病毒,经We stern-blot鉴定,最终获得能正确表达狂犬病毒G蛋白的重组疫苗两株:PGM-T K13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5;出现的荧光斑点,发生重组但尚未纯化的病毒1株:PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP。G蛋白抗原ELIS A检测发现G蛋白较大量的分泌性表达到细胞培养液中。免疫绵羊后血清抗体的ELISA检测结果显示:两株重组疫苗株均能在绵羊体内表达G蛋白并成功诱导机体产生抗体,与羊痘病毒疫苗株差异极显著;而G蛋白膜外区重组疫苗株的抗体水平高于G蛋白全长重组疫苗株,且差异显著。狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的成功构建为狂犬病毒活载体疫苗研发奠定了基础,也为羊狂犬病防控提供了新思路和技术路线。