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目的:心肌缺血再灌注诱导的细胞死亡受多个基因的调控。最近文献报道已经观察到:在败血症的小鼠心肌miR-223-5p和miR-223-3p的表达发生变化而且发挥其生物学效应;同时发现,miR-223-3p在缺血再灌注心肌中表达水平明显上调。近年来实验证明细胞程序性坏死是心肌细胞死亡的重要方式,而且受基因的调控;同时文献已经报道:缺血再灌注上调心肌RIP1(Receptor-interacting protein 1,受体相互作用蛋白1)、RIP3(Receptor-interacting protein 3,受体相互作用蛋白3)等坏死通路相关蛋白表达。本实验主要观察miR-223-5p/-3p是否协同调控缺血再灌注心肌诱导的心肌细胞程序性坏死。方法:本实验中,我们应用Real-time PCR观察在体和离体缺血再灌注小鼠心肌miR-223-5p和-3p的动态表达变化。应用pre-miR-223转基因小鼠和敲除基因小鼠的在体LAD(Left anterior descending branch,左前降支)阻断心肌缺血再灌注模型和离体全心缺血再灌注模型,从器官水平观察:两组小鼠心肌梗死面积和再灌注后心功能恢复的参数;从细胞水平观察:两组小鼠再灌注期漏出液LDH(Lactate dehydrogenase,乳酸脱氢酶)水平和心肌冰冻切片碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色心肌细胞坏死的程度。通过western blotting观察RIP1、RIP3和MLKL(Mixed-lineage kinase domain-like protein,混合谱系激酶结构域蛋白)蛋白在pre-miR-223转基因组小鼠和敲除基因组小鼠,在体心肌缺血再灌注期的表达水平;pre-miR-223敲除基因组小鼠应用RIP1激酶抑制剂NEC-1s(necrostatin-1s)预处理,从器官水平和细胞水平观察阻断细胞程序性坏死通路后,对心肌缺血再灌注损伤的影响效应。通过Luciferase报告基因系统(Luciferase reporter assay,双荧光素酶)观察,miR-223-5p 与 DR6(死亡受体 6)和 TNFR1(Tumor necrosis factor receptor 1,肿瘤坏死因子受体1)3’UTR的相互作用情况;通过western blotting观察 miR-223-5p 的靶蛋白 DR6 和 TNFR1、miR-223-3p 的靶蛋白 NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)和 IKKα(IkB kinase α),在 pre-miR-223转基因组小鼠和敲除基因组小鼠心肌的表达水平。通过Real-time PCR观察pre-miR-223转基因组小鼠和敲除基因组小鼠在体心肌缺血再灌注后炎症介质TNF-α(tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α)和 IL-1β(lnterleukin-1 β,白介素-1β)的mRNA(Messenger RNA,信使RNA)的表达水平。结果:Real-time PCR结果显示:miR-223-5p和-3p在小鼠在体和离体心肌缺血再灌注早期表达上调。在pre-miR-223转基因组小鼠,在体和离体心肌缺血再灌注模型中,与WT(wild type)对照组比较,心肌梗死面积明显减少、再灌注期间心功能指标明显恢复、心肌漏出液的LDH水平明显降低、PI染色阳性心肌细胞数目明显减少;pre-miR-223敲除基因组小鼠的心功能恢复指标和细胞坏死水平,与对照组比较则与其相反。Western blotting的结果显示:pre-miR-223转基因组小鼠在基础状态下,与WT组比较,RIP1、RIP3蛋白表达明显下调,但MLKL无明显差异;然而在心肌缺血再灌注后RIP1、RIP3和MLKL表达水平明显上调,但上调水平明显低于对照组;pre-miR-223敲除基因组小鼠的RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达水平同样表现出相反结果,与WT组比较,RIP1、RIP3表达明显上调,但MLKL无明显差异,然而在心肌缺血再灌注后RIP1、RIP3和MLKL表达明显上调,上调水平明显高于对照组。用NEC-1s对pre-miR-223敲除基因组小鼠和WT小鼠预处理后,在体和离体心肌缺血再灌注模型显示:pre-miR-223敲除基因组小鼠和WT小鼠的心心肌梗死面积减少、心功能明显恢复、心肌漏出液LDH水平下降、心肌冰冻切片的PI染色阳性坏死细胞明显减少。Luciferase报告基因系统结果显示:与miR-223-5p共转染后,明显下调TNFR1和DR6 3’UTR的luciferase的表达,分别为对照组的0.51和0.72倍。Western blotting结果显示:在pre-miR-223转基因小鼠组,与对照组比较,miR-223-5p 靶蛋白 TNFR1 和 DR6,miR-223-3p 靶蛋白 NLRP3 和 IKKα表达明显下调;而在pre-miR-223敲除基因小鼠组,与对照组比较,miR-223-5p靶蛋白TNFR1 和 DR6,miR-223-3p 靶蛋白 NLRP3 和 IKKα表达明显上调。Real-time PCR结果显示:pre-miR-223转基因组小鼠在体心肌缺血再灌注后,与对照组比较,炎症介质TNF-α和IL-1β的mRNA的表达水平明显下调,而pre-miR-223敲除基因组小鼠在体心肌缺血再灌注后,炎症介质TNF-α和1L-1β的mRNA的表达水平明显上调。结论:MiR-223-5p和-3p在心肌缺血再灌注模型中分别通过多靶点、协同抑制细胞程序性坏死来保护心肌细胞,因此,pre-mir-223是治疗缺血性心脏病的新的靶点与方法。