一、研究背景 着色芽生菌病是由着色真菌侵犯皮肤深部组织所引起的疾病，该病在热带、亚热带和温带常见。其致病菌主要包括着色霉属(裴氏着色霉、紧密着色霉)、枝孢霉属(卡氏枝孢霉)、喙枝孢霉属(播水喙枝孢)及瓶霉属(疣状瓶霉)等；在空气干燥的寒温带卡氏枝孢霉是常见致病菌，而在湿热带裴氏着色真菌是主要致病菌。在我国北方以卡氏枝孢霉引起着色芽生菌病最多见，而南方，尤其两广、福建一带则以裴氏着色真菌引起多见。Fonsecaea monophora为近年荷兰学者De Hoog首次报道的从裴氏着色霉中分离出的一个新的菌种，Fonsecaea monophora与裴氏着色霉在形态学上有极高的相似性，而在致病性上Fonsecaea monophora更可能是机会性感染菌。临床表现上Fonsecaea monophora的变异更大，并有亲中枢神经性。国外已见Fonsecaea monophora致中枢感染报道。我科近10年确诊约20余例着色芽生菌病，病原菌最初均报道为裴氏着色霉。但近期的DNA序列分析证实部分裴氏样着色霉是Fonsecaea monophora。外伤植入可能是着色芽生菌病的感染途径，皮损随着疾病的进展可表现多型性损害，最终形成纤维化、水肿。由于感染性肉芽肿和组织纤维化形成导致其治疗尤其是根治非常困难。着色芽生菌病的治疗效果常与菌种，皮疹的严重度及选用的抗真菌药物有关。卡氏枝孢霉对药物治疗更敏感，而皮损部位的水肿、纤维化减少了药物的组织浓度也增加了治疗的困难。文献报道的治疗方法包括静脉给药：两性霉素B，口服给药：特比萘芬250-500 mg／天；伊曲康唑200—400 mg／天；5-氟胞嘧啶联合特比萘芬或伊曲康唑等，外科方法：手术切除、冷冻或热疗。在疾病的早期外科切除、局部热疗和液氮冷冻治疗可取得一定的效果，但随着病情严重度的增加，药物治疗成为获得理想疗效的重要的不可缺少的选择。一些新的抗真菌药：伏立康唑、泊沙康唑及棘白霉素在体外药敏试验中均显示对丝状真菌的高度抗菌活性，但它们在治疗着色芽生菌病中的有效性尚有待进一步证实。目前认为伊曲康唑或特比萘芬持续给药是治疗该病的较理想的方法，但缺乏标准的治疗方案，且复发常有发生，部分病例对传统的单一抗真菌治疗显示无效。因此，一些学者开始探讨联合应用抗真菌药治疗着色芽生菌病的有效性。已有文献报道伊曲康唑与特比萘芬联合在体外对白念珠菌、Scedosporium prolificans、Pythium insidiosum均有协同抗菌活性，伊曲康唑与特比萘芬有协同作用的分子机制可能在于二者阻断了真菌类固醇合成的共同通路中不同的作用点。药敏研究证实伊曲康唑与特比萘芬联合抗念珠菌，其最小抑菌浓度仅为原剂量的四分之一，Ryder等体外研究证实伊曲康唑与特比萘芬联合抗曲菌有协同作用。个别文献报道亦提示联合抗真菌药治疗着色芽生菌病的有效性，巴西学者Gupta等联合应用伊曲康唑与特比萘芬成功治愈4例既往用单一抗真菌药无效的裴氏着色霉所致着色芽生菌病患者，但联合抗真菌药治疗着色芽生菌病的有效性尚需更多的临床资料证实。 Fonsecaea monophora为近年从裴氏着色霉中分离出的一个新的菌种，目前尚缺乏相关的体内、体外药敏试验数据，为了探讨更理想的治疗着色芽生菌病的临床方案，本研究采用美国临床实验室标准化委员会制定的M38-A方案研究了伊曲康唑和特比萘芬在体外对18株Fonsecaea monophora的抑菌作用和联合用药时药物间相互作用；并回顾分析了5例患者临床疗效与方案，以期为今后的临床用药提供更好的参考。 二、研究目的 1.观察伊曲康唑、特比萘芬单用及联合应用对Fonsecaea monophora的体外药敏作用。 2.回顾分析5例患者的MIC值与与临床治疗方案、疗效的关系，其中4例患者资料完整作病例报道。 3.探讨联合用药在治疗着色芽生菌病中的意义。 三、实验对象和方法 　　1.菌悬液制备：18株Fonsecaea monophora菌株均接种在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上35℃培养7-10天活化2次，以保证其纯度和活力，取1ml 0.85％含吐温的生理盐水加入试管内，轻抽吸后，将菌液吸到无菌试管中静置3-5分钟，再取上层悬浮液窝悬15秒，用血细胞计数板计数并调整菌悬液浓度至106CFU／ml，再用RPMI 1640液体培养基稀释50—100倍，得到0.5—5×104CFU／ml的2倍终浓度的接种菌悬液。 2.使用一次性无菌96孔平底板进行药敏试验。首行(首列)第一孔作为阴性对照，为200μl含1％DMSO的RPMI1640培养液；第8行(第12列)为生长对照，为100μl含2％DMSO的RPMI1640培养液；第一行的2-11孔和第一列的2—8孔为单独用药的2倍终浓度的药物稀释液100 μl；其余孔为两药联合时的4倍终浓度的药物稀释液50 μl。微稀释板置-80℃保存备用。在加入接种菌悬液100 μl后联合药敏试验药物最终浓度范围：特比萘芬和伊曲康唑均是0.002-1 μg／ml。 3.接种、培养和结果的判读：除阴性对照孔外，每孔加入2倍终浓度菌悬液100μl，35℃培养，5—7天观察结果。以肉眼观察所见能100％抑制真菌生长的最低药物浓度为MIC终点。 4.药物相互作用分析：应用分数抑菌浓度指数(the fractional inhibitory concentration index，FICI)描述药物间相互作用。表达式为FICI=CAcomb／MICAalone+CBcomb／MICBalone，MICAalone和MICBalone。是药物A和药物B单独用药时各药的MIC值；CAcomb和CBcomb是药物A和药物B联合用药时各药的MIC值。FICI值的解释为：FICI<0.5有协同作用，FICI≥0.5但<1.0有相加作用，FICI≥1.0但<4为无关作用，FICI≥4有拮抗作用。 5.回顾分析5例患者的MIC值与与临床反应的一致性，其中4例患者资料完整作病例报道。 6.统计方法：采用SPSS16.0统计软件包处理实验数据，选择配对资料的Wilcoxon符号秩和检验，显著性水准α设为0.05。 四、实验结果 1.质控株近平滑念珠菌ATCC22019在每次的药敏试验中均进行重复试验，该菌株在35℃、48 h培养后均生长良好，该质控株的伊曲康唑的MIC值范围是0.125-0.25 μg／ml。特比萘芬的MIC质控范围是>8 μg／ml。联合药敏试验结果显示有协同作用，其FICI范围是0.31-0.38。 2.特比萘芬和伊曲康唑联用抗18株Fonsecaea monophora的体外药敏试验显示：单用药时特比萘芬MICs范围0.0313-0.5 μg／ml，MIC90和MIC50分别是0.25 μg／ml和0.125 μg／ml；伊曲康唑MICs范围0.008-0.125 μg／ml，MIC90和MIC50分别是0.0625 μg／ml和0.0313 μg／ml；联用药时特比萘芬MICs范围0.008—0.0313 μg／ml，MIC90和MIC50分别是0.0313 μg／ml和0.01565μg／ml；伊曲康唑MICs范围0.004-0.01565 μg／ml，MIC90和MIC50分别是0.008 μg／ml和0.004 μg／ml；特比萘芬的MIC几何均数较单用药时显著减少(从0.116减至0.018；p<0.001)；伊曲康唑的MIC几何均数较单用药时显著减少(从0.034减至0.006；p<0.001)，其差异有显著性。 3.18株中12株(67％)其FICI值<0.5，证实有协同作用；4株(22％)FICI>0.5且FICI<1.0，证实有相加作用；2株(11％)FICI>1.0且FICI<4.0，证实有无关作用；未观察到拮抗作用。 4.5例患者接受特比萘芬和／或伊曲康唑治疗，4例治愈，1例改善。其中4例资料完整，本研究就其临床表现、诊断及治疗方案做病例报道。 五、结论 1.首次对特比萘芬、伊曲康唑联合治疗Fonsecaea monophora所致着色芽生病进行体外药效评价。 2.18株中12株(67％)证实有协同作用；未观察到拮抗作用。联合用药获得的MICs远远低于特比萘芬、伊曲康唑在血浆中所能达到的浓度峰值。 3.5例患者均为Fonsecaea monophora所致的着色芽生菌病，用伊曲康唑和／或特比萘芬治疗，其临床反应与体外药敏试验结果基本一致。