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呼吸道上皮细胞的体外培养对离体研究呼吸道的生理功能,呼吸道疾病的致病机制以及诊疗都具有重要意义。气液界面培养技术(air-liquid interface,ALI)是一种将气管、鼻息肉等呼吸道组织上的原代上皮细胞分离后,经传代扩增细胞数量后,再接种到预包被胶原的0.4umTranswell培养皿中进行培养,该培养皿的下层加入分化培养基,而培养皿中的细胞上层则暴露于空气。经过一段时间的ALI培养后,上皮细胞经过分化后就能产生纤毛细胞、杯状细胞、基细胞等多种细胞,并由细胞分泌的粘液覆盖,产生类似于体内生理结构和功能的假复层纤毛柱状上皮组织。目前病毒体外培养和增殖方法主要是应用普通的细胞培养、鸡胚和动物模型。动物模型难以筛选和构建,费时耗力而且涉及各种伦理因素,而鸡胚和细胞培养是一种既方便又有效的病毒培养分离方法。但鸡胚培养仅限于有限的病毒种类的培养和扩增,难以开展病毒生物学特性及致病机制的研究。而普通的细胞培养方式使细胞间缺少细胞外基质,中断细胞间的各种连接限制细胞的分化发育,致使细胞并不能真实的反应体内的真实功能特征,也不具有类似机体内细胞的立体结构,更不像机体器官那样包含有多种类型的细胞,这就严重限制了对于这些致病性病原体的致病机制的研究。此外,很多病毒在普通的这种细胞培养体系中不能或难以生长和培养。ALI培养能够模拟细胞在人体内的生长状态,形成具有类似组织结构和生理功能的假复层柱状上皮,是在模拟人体结构方面细胞培养技术的一次飞跃,克服了上述三种培养体系分离病毒的缺陷。这一技术对研究和探讨上皮细胞的多种生理功能及在病毒致病机制方面具有最要意义。但该种分离和培养病毒体系的技术要求较高,其研究和推广还处在不断完善和发展的过程。近三十年来,全球新发和再发传染病不断涌现,对人类健康造成巨大威胁。其中一半以上是由病毒引起,如流感病毒(influenza virus)、人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)、C组鼻病毒(Human rhinovirus C,HRV-C)、人冠状病毒(Human coronavirus)和人偏肺病毒(human Metaenumovirus,hMPV)等,而部分新发病毒(HBoV、HRV-C,HKU1等)的体外培养分离非常困难,从而限制了对其机制的研究。为了实现HBoV等难培养病毒的体外培养增殖,为呼吸道相关病毒的体外致病机制的研究提供一种更有效的细胞体系,本研究建立了一套完整的呼吸道原代上皮细胞的气液界面培养体系,通过搭建体外上皮细胞ALI培养的技术平台,在体外培养环境下最大程度模拟和再现上皮细胞的体外分化,成功培养出假复层纤毛柱状上皮细胞,形成了标准化的上皮细胞ALI培养技术方案,并实现了人博卡病毒等难培养病毒的体外培养增殖,为新发、现存及潜在难培养病毒的体外分离提供了技术支撑和研究平台。本研究的主要结果和结论如下：1、摸索建立了一套完整的原代呼吸道上皮细胞ALI培养方案,体外成功培养获得具有类似组织结构和生理功能的假复层呼吸道柱状上皮细胞。主要包括：(1)建立了适用于ALI培养的原代呼吸道上皮细胞的分离培养方案。体外成功分离和培养(传代)小鼠、猪和人的呼吸道上皮原代细胞,经细胞形态及免疫荧光染色鉴定证实。(2)建立了原代呼吸道上皮细胞ALI培养方案。通过比较不同培养基的培养效果,并进行了多个指标的鉴定后证实本实验ALI培养后的呼吸道上皮细胞的形态学,MUC5AC蛋白,IV型p-微管蛋白(β-tubulinIV),闭合小环蛋白-1(Zona occludens-1)的表达及紧密连接和假复层的形成情况都与气管组织结构类似。2、应用ALI培养的呼吸道上皮细胞成功实现了多种呼吸道病毒的培养和增殖,为深入开展致病机制研究奠定了基础。主要包括：(1)多种病毒实现增殖。在ALI培养的呼吸道上皮细胞接种阳性病毒标本后,包括流感病毒、腺病毒、hMPV和HBoV,荧光定量PCR检测结果显示所有病毒均有良好的增殖效果。(2)细胞接种病毒后出现了明显的免疫反应。细胞因子和趋化因子的测定和分析结果显示,ALI培养的呼吸道上皮细胞接种博卡病毒后多种细胞因子和趋化因子都有升高,包括IL-6、IL-8、IP-10、TNF-α和CCL5。在感染120h时和对照组比较IL-6、IP-10和CCL5的升高最为明显。IL-1β和MIP-1b未反映出变化。综上所述,我们成功建立了三种动物类型(小鼠、猪和人类)的呼吸道上皮细胞的原代分离培养及ALI培养方案,并利用培养分化的假复层纤毛柱状上皮细胞实现了多种呼吸道病毒的体外培养,为难培养呼吸道病毒的体外细胞培养提供了技术平台,为深入开展呼吸道病毒致病机制的研究奠定了基础。