猪瘟是对养猪业危害严重的一种A类传染病,其致病原是猪瘟病毒（CSFV）。E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要保护性抗原蛋白，应用真核细胞表达系统表达的E2蛋白免疫动物，对强毒的攻击有较好的保护作用。利用乳腺生物反应器生产有经济价值的生物活性蛋白已成为当前生物领域研究的热点，制备乳腺生物反应器的关键环节是构建高效、特异的表达载体，而β-乳球蛋白（BLG）是反刍动物乳汁中特异的主要乳清蛋白。本研究以牛β-乳球蛋白基因上游调控成分作为启动子，利用本实验室已有的猪瘟病毒E2基因，构建了E2基因的乳腺特异表达载体，并通过电穿孔方法转染体外培养的牛乳腺上皮细胞，以验证表达载体构建的合理性和E2蛋白的表达效率。并借助抗性基因Kana/neo（卡那霉素/新霉素抗性基因）和报告基因EGFP（增强型绿色荧光蛋白报告基因）来筛选、纯化阳性克隆细胞，为利用核移植技术制作转基因动物提供细胞来源，同时也为猪瘟基因工程疫苗的研究提供了一种手段。研究结果如下：利用PCR方法从奶牛血中克隆了牛β-乳球蛋白基因上游调控成分（737bp），其中包括5′侧翼序列（645bp）和第一外显子中信号肽序列（92bp）。PCR产物回收纯化后，克隆在pMD 18-T载体的T位点。序列分析表明，该序列与Genbank中已有序列同源性均大于90%。DNA Star分析表明，此调控成分含有多种调节因子结合位点或反应元件，包括视黄酸反应元件（RARE）、佛波酯反应元件（TRE）、乳腺特异性因子（MSBF）和核因子1（NF1）结合位点等，这提示此调节元件可调控外源基因在乳腺细胞中表达，可进一步用于构建乳腺特异表达载体。通过重组PCR方法，将克隆的牛BLG上游调控成分与猪瘟病毒E2基因连接起来，并克隆到pMD 18-T载体的T位点，形成pBE质粒。HindⅢ/XbaⅠ、AseⅠ酶切pBE质粒，获得BE片段。真核表达质粒pEGFP-C1在经AseⅠ单酶切和5′端去磷酸化处理后，与BE片段经T4 DNA连接酶连接起来，构建了猪瘟病毒E2基因的乳腺特异表达载体。此载体含有报告基因EGFP（增强型绿色荧光蛋白基因）、抗性基因（Kana/neo基因）、乳腺特异表达调控成分（牛β-乳球蛋白基因上游调控成分）以及目的基因（猪瘟病毒E2基因）。采用电穿孔方法将重组表达质粒转化体外培养的牛乳腺上皮细胞，经G418筛选培养7天后，荧光显微镜下观察报告基因即增强型绿色荧光蛋白基因的表达情况。结果表明猪瘟病毒E2基因表达载体通过电穿孔方法成功地转化了体外培养的牛乳腺上皮细胞，并实现了报告基因的表达。