研究背景口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤和肿瘤相关致死原因之一,每年新增病例约30万,死亡约15万人。尽管目前已经存在成熟的综合治疗手段,OSCC在近20年中的5年生存率仅升高了 5%。治疗效果不佳的主要原因之一在于OSCC在疾病早期即容易发生局部浸润和远处转移。因此,调节肿瘤细胞侵袭活性的干预措施将可能为OSCC的治疗带来希望。细胞的运动行为主要依赖于细胞骨架的动态变化,包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架参与细胞运动的整个过程,为细胞运动提供动力,并参与运动调节因子的细胞内运输和分泌。驱动蛋白(kinesin,KIF)家族是一类与细胞骨架关系极为紧密的动力蛋白,与微管结合参与细胞分裂和胞内物质运输过程。许多KIF成员参与微管的组装和分解,从而调节细胞运动活性。我们之前的研究发现KIF家族成员在OSCC肿瘤局部高表达,表达水平与淋巴结转移风险相关。这提示KIF可能是OSCC发展、浸润和远处转移的重要调控因子,但具体的调节机制尚不清楚。除肿瘤细胞自身的生物学行为之外,肿瘤发展还受到周围组织的调控。肿瘤浸润免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,其中巨噬细胞所占比例最高。巨噬细胞根据外源性信号的调节可分化为具有抗肿瘤活性的M1型细胞和促进肿瘤的M2型细胞。肿瘤局部巨噬细胞的数量和表型、功能均与OSCC的侵袭转移风险有关。这提示OSCC是一种免疫敏感性肿瘤,靶向巨噬细胞的免疫治疗可能成为OSCC的可能治疗手段。褐藻多糖是一种提取自海洋植物褐藻的天然硫酸化多糖类物质,具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种活性,是良好的营养保健品和治疗药物。抗肿瘤是褐藻多糖的主要功能之一。褐藻多糖不仅影响肿瘤细胞的凋亡、迁移、侵袭等生物学行为,还对机体多种免疫细胞活性产生影响。然而,目前尚不清楚褐藻多糖对OSCC的发展是否存在影响。在本研究中,我们检测了褐藻多糖对舌鳞癌细胞系CAL27侵袭活性的影响以及对巨噬细胞募集和驯化的作用,并初步探究了作用机制。我们发现褐藻多糖通过KIF4A/MMP-2的作用通路调节CAL27细胞的侵袭活性,并通过调节CAL27细胞CCL3的分泌调节其对巨噬细胞的募集和驯化作用。第一部分褐藻多糖通过KIF4A/MMP-2通路调节口腔癌细胞侵袭活性目的KIF家族成员在细胞运动中发挥重要作用,但其在OSCC侵袭转移中的作用及调控机制尚未完全阐明。该部分将探究KIF家族成员在OSCC细胞侵袭行为中的影响,以及天然提取物褐藻多糖对OSCC细胞KIF表达及侵袭活性的调控作用。方法1.不同浓度(0,10,50,100,200μg/ml)的褐藻多糖处理人舌鳞癌细胞系CAL27细胞48 h,transwell侵袭实验分析褐藻多糖对CAL27侵袭活性的影响。2.CCK-8实验检测100 μg/ml褐藻多糖对CAL27细胞增殖活性的影响3.利用qRT-PCR技术探究褐藻多糖对CAL27细胞金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表达的影响。4.利用qRT-PCR技术分析褐藻多糖对CAL27细胞KIF家族成员表达的影响。5.向CAL27细胞转染KIF4AsiRNA以干扰其表达,利用transwell侵袭实验和qRT-PCR技术分别探究KIF4A敲除对CAL27细胞侵袭活性和MMP-2表达的影响。结果1.100及200 μg/ml的褐藻多糖均显著抑制人舌鳞癌细胞系CAL27细胞的侵袭活性,其中100 μg/ml的褐藻多糖对CAL27细胞增殖无明显影响。2.100 μg/ml的褐藻多糖显著抑制CAL27细胞MMP-2的转录水平,但对MMP-9和MMP-14表达无明显影响。3.褐藻多糖显著抑制CAL27细胞KIF4A的转录水平,但对其他KIF家族成员如KIF1B、KIF2A、KIF3A、KIF3B和KIF5B的转录无明显影响。4.敲除CAL27细胞KIF4A表达显著抑制其MMP-2转录和侵袭活性。结论我们的研究首次发现褐藻多糖抑制人舌鳞癌细胞系CAL27的侵袭和MMP-2表达,这一作用可能需要KIF4A的参与。我们的研究结果提示KIF4A可能成为OSCC侵袭行为调节的可能作用靶点。第二部分褐藻多糖通过CCL3影响OSCC细胞对巨噬细胞的募集和驯化目的巨噬细胞影响口腔癌的发展过程,是口腔癌患者免疫治疗的潜在作用靶点。褐藻多糖具有免疫调节活性,之前的研究显示其影响巨噬细胞的迁移活性。然而目前尚不清楚褐藻多糖对口腔癌微环境中浸润的巨噬细胞有何影响。在该部分的研究中,我们探究了褐藻多糖对OSCC细胞对巨噬细胞募集和驯化的影响,并初步探究了作用机制。方法1.体外诱导生成THP-1来源巨噬细胞。收集褐藻多糖处理后的CAL27细胞上清,利用transwell实验探究褐藻多糖作用上清对THP-1来源巨噬细胞募集的影响。2.利用qRT-PCR和ELISA方法探究褐藻多糖对CAL27细胞趋化因子表达的影响。3.向有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体,检测CCL3对CAL27细胞募集THP-1来源巨噬细胞的影响。4.用有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基处理THP-1来源巨噬细胞。利用qRT-PCR和ELISA技术检测CAL27细胞条件培养基对巨噬细胞促炎及抗炎细胞因子分泌的影响。5.向有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体,之后处理THP-1来源巨噬细胞。利用qRT-PCR和ELISA技术检测CCL3对巨噬细胞细胞因子分泌的影响。结果1.褐藻多糖处理后的CAL27细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞的募集作用显著增强。2.褐藻多糖显著促进CAL27细胞CCL3的转录和分泌,而对其他CCL趋化因子的表达无明显影响,如CCL2,CCL4,CCL5和CCL22等.3.加入CCL3中和抗体后,CAL27细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞的募集作用显著减弱。4.褐藻多糖处理后的CAL27细胞条件培养基促进THP-1来源巨噬细胞M1型因子IL-1和TNF-α的表达,而抑制M2型因子CCL22的表达。5.向CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体显著逆转褐藻多糖对IL-1和TNF-α表达的促进作用。结论我们的研究发现褐藻多糖促进CAL27细胞对巨噬细胞的募集作用,并驯化巨噬细胞向M1方向分化。这一过程依赖于CCL3的表达。这一研究结果提示褐藻多糖可能影响口腔癌局部的免疫状态,特别是肿瘤浸润巨噬细胞的数量及功能。褐藻多糖可能作为OSCC患者免疫治疗的辅助治疗手段。