研究背景随着通信技术的发展,人与人之间的交往日趋频繁。为了在学习和工作中获得更多的机会,人们开始花费更多精力来塑造良好的外形。于是,致力于塑造人类美好外形的各种学科应运而生。日常交往中,一个人的相貌往往是第一印象的主要组成部分。而头发则是这一组成部分中的主要成分之一。许多应用于毛发保健的产品被投放到市场,产生了庞大的经济效应。毛囊被覆在哺乳动物体表,是哺乳动物皮肤的附属器官之一。它由上皮成分和真皮成分构成,上皮成分包括外根鞘、内根鞘、毛母质及毛干,真皮成分包括毛乳头及真皮鞘。上皮成分与真皮成分的相互作用贯穿于毛囊的发育及周期性生长的全过程。一旦上皮成分和真皮成分的相互作用出现了异常,毛囊的形态就会发生改变,从而影响人的外观。临床上表现为各种形式的秃发。如某些化疗药物能够促使毛发迅速由生长期进入退行期和静止期,临床上会表现为使用后毛发大量剥脱。内分泌的激素如雄性激素能使毛囊出现微型化,并使毛发周期停滞在静止期,临床上表现为逐渐加重的秃发。各种原因引起的秃发给人们的社会生活带来了诸多不便。目前临床上治疗秃发的方法主要有药物疗法和手术疗法。用于治疗秃发的药物主要有非那雄胺以及米诺地尔等。非那雄胺通过抑制睾酮转化为双氢睾酮从而抑制毛囊微型化,毛发得以重新增粗变长,秃发的症状得以缓解。米诺地尔治疗秃发的机制则是通过促进毛囊中的毛乳头细胞分泌VEGF,加强其毛发诱导能力,从而促进毛囊的生长。然而,尽管药物治疗能够在一定时期内缓解秃发症状,但是一旦停止用药,秃发的现象又会复发。除此之外,长期使用药物治疗秃发会发生较明显的副作用。另外,并非所有人使用治疗秃发的药物都一样有效。为了解决这些问题,手术疗法正越来越广泛地被人们采用。人的肉眼可以分辨的毛发浓密程度上限约为每平方厘米面积内30根毛发,小于正常人的平均毛发浓密程度。也就是说理论上可以通过毛发的合理分布来掩盖原来秃发的区域,同时又不至于使供区毛发看起来比手术前稀疏。上世纪60年代以前由于技术的限制,人们只能通过扩张头皮组织行皮瓣转移的方法来实现毛发的重新分布,这不仅在外形上难以准确地实现秃发区的缩减,而且创伤较大。而到了上世纪60年代以后,随着显微外科技术的发展以及毛囊单位概念的提出,毛发的重新分布得以用毛囊单位显微移植的方法来实现。通过在供区切取头皮条进行分离或直接用钻头在供区钻取毛囊单位的方法,得到大量可供移植的毛囊单位,然后按照受区的性状选取相应的毛囊单位进行移植,可以使秃发区定量地得到类型适宜的毛囊单位。在供区选择方面,供区优势理论认为移植到受区的毛发将保持其在原有供区时的性状。这就使得毛发浓密的枕部成为了良好的毛发供区。因为枕部的毛发较少受到毛囊微型化的影响,因此在枕部取得的毛囊单位在被移植到秃发区之后亦不会发生微型化。此外,在枕部用切取或钻取得到毛囊单位的方法所留下的瘢痕均因为周围毛发的掩盖而不明显。然而其应用也因为部分患者的供区不足而受到了限制。毛囊单位移植术毕竟不能增加毛囊的数量,而只是改变了毛囊的分布而已。为了实现毛囊数量的增加,毛囊组织工程开始迅速发展。毛囊组织工程致力于毛囊的重建。毛囊发育所需的天然微环境成分复杂,目前还难以在体外完全地进行模拟。因此目前尚无法在体外实验中重建出结构成熟的毛囊。对于毛囊的体内重建,目前已经取得了大量的成果。许多动物模型被成功地构建出来。常用的动物模型有小室模型、注射模型、皮瓣模型以及三明治模型。各种动物模型有着不同的优缺点。其中小室模型所重建出的毛发的方向较为一致,可以于动物体表直接观察到重建出来的毛发纤维。通过按不同的需要使用不同的动物模型,人们开始对各种细胞的毛发诱导能力的变化条件进行探索,以求找到能够大量增殖并维持较强的毛发诱导能力的细胞,为将来在体外实验中重建出结构完整、功能正常的毛囊创造条件。实验中人们发现那些原本具有毛发诱导能力的细胞在经历了增殖传代之后其子代细胞的毛发诱导能力明显减弱。而通过将某些生物活性物质作用于毛发诱导能力较弱的细胞,可以加强这些细胞的毛发诱导能力。较为常见的一类是作用于毛囊真皮成分中的毛乳头细胞,使体外培养后的毛乳头细胞聚集形成毛乳头的能力得到加强。真皮细胞的聚集是毛囊发育的基础。启动毛囊发育的信号称为第一真皮信号。这种信号广泛存在于胚胎真皮细胞中,胚胎真皮细胞分泌该信号,而其中一部分胚胎真皮细胞同时还是该信号的靶细胞,它们接受第一真皮信号的刺激而发生聚集形成真皮聚集体,开始了毛囊的发育过程。为了探索这种胚胎期的真皮信号对成体细胞的作用,我们开始了实验。因为第一真皮信号广泛分布于胚胎期小鼠的真皮且于胚胎期第14天达到分泌高峰,所以本实验选取胎龄14天的胚鼠真皮细胞作为信号源,观察其对成体小鼠真皮细胞毛发诱导能力的影响。通过统计重建出的毛发数目来评价细胞的毛发诱导能力。为便于毛发数目的统计,本实验选取经典的小室模型来重建毛发,因为小室模型重建出的毛发生长于体表且方向一致,便于收集和计数。本实验共分为两部分进行。一、小室模型的制作及细胞毛发诱导能力的检测目的：观察构建的小室模型是否便于毛发收集及毛发计数,是否能有效反映细胞的毛发诱导能力强弱。同时观察不同细胞的毛发诱导能力强弱。为后续实验做准备。方法：1、取医用聚丙烯材料制成的试剂瓶内塞,用针头在其底部中央打孔制成小室。2、处死出生1天内的C57BL/6近交系小鼠,取其背部皮肤分别制备新鲜分离的新生鼠真皮细胞悬液及新鲜分离的新生鼠表皮细胞悬液,并用DiI细胞膜红色荧光探针标记新鲜分离的新生鼠真皮细胞悬液。3、另取新生鼠真皮细胞经原代培养后制成细胞悬液,并进行DiI细胞膜红色荧光探针标记。4、取胎龄14天的胚鼠皮肤制备胚鼠真皮细胞悬液,并进行DiI细胞膜红色荧光探针标记。5、呈圆形剪去一块裸鼠背部皮肤,置入小室,将各种细胞按照分组方式经由小室上的小孔注入小室。6、分别建立新鲜分离的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组；培养的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组；胚鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组；新鲜分离的新生鼠真皮细胞(1×107)组；新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组；胚鼠真皮细胞(1×107)组。对各组的毛发重建情况进行观察。结果：新鲜分离的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组有大量毛发形成；培养的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组有少量毛发形成；胚鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组无毛发形成；新鲜分离的新生鼠真皮细胞(1×107)组无毛发形成；新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组无毛发形成；胚鼠真皮细胞(1×107)组无毛发形成。新鲜分离的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组的毛发数量与培养的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组的毛发数量的差异有统计学意义(n=3,t=14.85,p<0.05)。取有毛发形成的组织进行切片于荧光显微镜下观察可见所有毛囊的毛乳头均为DiI荧光阳性。所形成的毛发排列整齐。在大体观、组织学观察及扫描电子显微镜下均与正常C57BL/6近交系小鼠的背部毛发结构无明显差异,能进行正常的毛发周期循环。结论：1、以试剂瓶内塞构建而成的小室能够有效地重建出排列整齐的毛发,便于毛发的收集和计数,可以被用于比较细胞的毛发诱导能力。2、毛囊的重建依赖于上皮细胞和真皮细胞的相互作用,二者缺一不可。3、新鲜分离的新生鼠真皮细胞在经历了体外培养后毛发诱导能力减弱。4、胎龄14天的胚鼠真皮细胞无法和新鲜分离的新生鼠表皮细胞相互作用形成毛囊。二、胚鼠真皮细胞辅助体外培养的新生鼠真皮细胞行毛囊重建的效果观察目的：观察胚鼠真皮细胞对体外培养后的新生鼠真皮细胞的毛发诱导能力的影响,并探讨其作用机制。方法：取以体外培养后的新生鼠真皮细胞(1×107)与新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)构建毛囊重建体系。在该体系中加入以DiI细胞膜红色荧光探针标记的胎龄14天的胚鼠真皮细胞(1×106)作为实验组,不加胎龄14天的胚鼠真皮细胞作为对照组。将实验组形成的毛发数量与对照组作比较。并取实验组形成的毛发进行组织学观察。结果：1.培养的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)+胚鼠真皮细胞(1×106)组亦即实验组有大量毛发形成,培养的新生鼠真皮细胞(1×107)+新鲜分离的新生鼠表皮细胞(1×107)组亦即对照组仅有少量毛发形成,二者的差异有统计学意义(n=3,t=6.75,p<0.05)。2.实验组的DiI荧光均位于毛囊间真皮。未发现DiI荧光阳性的毛乳头。结论：胎龄14天的胚鼠真皮细胞可以在由培养的新生鼠真皮细胞与新鲜分离的新生鼠表皮细胞构建的毛囊重建体系中起到辅助作用。使培养后的新生鼠真皮细胞仍能发挥较强的毛发诱导作用。